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王玉民

新虫 (小有名气)

[求助] 求助:请问做TOPO克隆时总是连接不上怎么回事啊?

请教高手:
我用Pfu酶扩增得到大约500bp的片段,与TOPO载体连接时,连接转化后总是不长斑是怎么回事啊?
有没有做过TOPO克隆的有什么好的经验指导一下啊?
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心晴
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yuxia82012

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

不会是感受态效率不高所致吧?
在等待中涅槃重生
4楼2011-10-11 14:36:47
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另一个天堂

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
amisking(金币+3): 鼓励应助发帖! 2011-10-11 21:56:13
1.涂板:玻璃棒温度过高或离酒精灯太近被烧死了:或者涂板时液体没涂干
2.确定目的基因是否连接上了载体
3.检验一下你的扩增片段
4.考虑是不是培养基的问题
2楼2011-10-11 09:58:25
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王玉民

新虫 (小有名气)

多谢!再请问1.如何确定是否连接上了载体?
2.如何检测扩增片段是否正确,大小用琼脂糖检测的是正确的,末端如何检测呢?
3.连接产物和感受态的比例多少最合适呢?
心晴
3楼2011-10-11 10:18:05
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lxj341401

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
1楼: Originally posted by 王玉民 at 2011-10-11 09:25:09:
请教高手:
我用Pfu酶扩增得到大约500bp的片段,与TOPO载体连接时,连接转化后总是不长斑是怎么回事啊?
有没有做过TOPO克隆的有什么好的经验指导一下啊?

TOPO vector 是invitrogen公司的一个TA克隆的质粒载体系列。http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/topota_man.pdf
Pfu酶是高保真酶,扩增后不带A的,所以你扩增得到大约500bp的片段如果没有经过加A处理,是不能直接用于TOPO vector做TA克隆的。
5楼2011-10-11 14:47:04
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