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王玉民

新虫 (小有名气)

[求助] 求助:请问做TOPO克隆时总是连接不上怎么回事啊?

请教高手:
我用Pfu酶扩增得到大约500bp的片段,与TOPO载体连接时,连接转化后总是不长斑是怎么回事啊?
有没有做过TOPO克隆的有什么好的经验指导一下啊?
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心晴
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王玉民

新虫 (小有名气)

引用回帖:
6楼: Originally posted by xiaoshu8833 at 2011-10-11 17:41:17:
这个答案靠谱~~要自己加一步的~~
PS:你扩增的片段纯化回收的方法也可能对后面的连接有影响~~

TOPO载体要求的连接片段是平端的,所以我才用Pfu酶去掉A的。
再请问一下,做转化的时候连接产物和感受态的比例是多少最合适呢?
心晴
8楼2011-10-12 11:52:35
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另一个天堂

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
amisking(金币+3): 鼓励应助发帖! 2011-10-11 21:56:13
1.涂板:玻璃棒温度过高或离酒精灯太近被烧死了:或者涂板时液体没涂干
2.确定目的基因是否连接上了载体
3.检验一下你的扩增片段
4.考虑是不是培养基的问题
2楼2011-10-11 09:58:25
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王玉民

新虫 (小有名气)

多谢!再请问1.如何确定是否连接上了载体?
2.如何检测扩增片段是否正确,大小用琼脂糖检测的是正确的,末端如何检测呢?
3.连接产物和感受态的比例多少最合适呢?
心晴
3楼2011-10-11 10:18:05
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yuxia82012

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

不会是感受态效率不高所致吧?
在等待中涅槃重生
4楼2011-10-11 14:36:47
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