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320080920001金虫 (正式写手)
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[求助]
平末端连接做不出来克隆
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大家好，我最近在做克隆，是把我以前做过的一个基因的点突变后的质粒（pFastbac1-GENE）设计引物（F和R，在R引物上带有PmlI的酶切位点，F和R内侧附近分别有PmlI和KpnI位点，均为单酶切位点），PCR完了后溶液回收Kit回收，浓度大概130ng/ul,70ul elute，之后我用PmlI和KpnI切（此处犯了一个错误，应该只用PmlI切，这样就不用后面切平了），然后跑胶，切胶回收，用的是Qiagen的胶回收试剂盒，浓度大概为30ng/ul,50ul eltue,而且260/230的值不到0.1，很低。然后用Klenow酶（large fragment）切平KpnI的位点，然后溶液回收。我把pEF-GENE用PmlI酶切（在我要替换的片段上下游有两个PmlI酶切位点），跑胶回收vector，浓度是60ng/ul。用CIP酶处理后消除5‘磷酸，防止自连。然后溶液回收。 最后用T4liase把insert和vector连接起来，转化涂板，我试过DH5a和T1，都没有长出来，这个质粒要的很急，最近我也快做完毕业设计回去答辩了，由于最后这个实验不顺利，我都不知道老板会不会要我，虽然我很想留在她的实验室。最近给自己的压力好大啊！ P.S.求技术指导，关心酱油之类的回帖不回勿怪哈！我后面有用pEF-GENE为模板做点突变PCR，但是由于片段是9KB左右，很难P出来。还在平行做PCR后用PmlI单酶切，这样就不用连接了，还在想要不要再设计一下引物，就在紧挨片段上下游，再做PCR，这样酶切后就不用胶回收，直接溶液回收了。 |
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320080920001
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16楼2012-04-23 03:56:37
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上面的几位我不能说什么但是基本都没说到点上，去磷酸化是必须的，不然自恋的概率非常大，建议这样做： 1 你用PCR产物做，请问是否使用的是高保真酶，如果是的话可以不用平末端酶切，建议使用T4核苷酸激酶加磷酸基，但理论是来说酶切也不是不可以，只是你使用的这个酶所切出来的平末端连接效率可能比较低（和酶有很大关系）。 2 转化涂板用VECTOR自连作对照，看看你去磷酸化的效果，平末端连接最好作对照。 3 什么都没有长说明载体自连都不存在，那么考虑一下是否抗生素出现问题，检查一下实验材料。 4 不知道你的载体是否也是酶切后变成的平末端，如果是这样，建议连接的时候温度放置在22度，并加入适量切你载体的内切酶，可以比较有效的防止自连，在这个温度下连接时间要超过24小时，否则失败的可能性很大。 5 如果T4连接酶不好用，建议使用TAKARA的SOLUTION I溶液，连接效率会高很多。 6 如果有PEG 4000或者PEG 8000可以适量加入，增加平末端连接效率。 |
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32008092000110楼2012-04-22 22:25:56