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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 平末端连接做不出来克隆
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320080920001

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
送鲜花一朵
silicare: 金币+5, BioEPI+1, 鼓励深入交流 2012-04-24 10:11:26
引用回帖:
10楼: Originally posted by huguangdong at 2012-04-22 22:25:56:
上面的几位我不能说什么但是基本都没说到点上，去磷酸化是必须的，不然自恋的概率非常大，建议这样做：
1 你用PCR产物做，请问是否使用的是高保真酶，如果是的话可以不用平末端酶切，建议使用T4核苷酸激酶加磷酸 ...

1.我是用的easyTaq扩的，不过下次可以尝试用FastPfu,不过T4核苷酸激酶加磷酸基（我们实验室有PNK），你是担心PmlI酶切的片段可能5‘端没有磷酸是吧？
2.我有做vector自连的对照，但目前还没结果，但是就像你第3条说的，什么也没长确实是自连不存在问题，我的板子是amp的，当时配了很多，师兄也在用这一批板子，我可以确认一下有没有问题，但是好像师兄已经做出来了（他自己的实验）。
4.我的vector和insert都是平末端，而且10ul的连接体系，其中加了1ul(63ng/ul)的vector（约9KB），2ul(30ng/ul)的insert(约500bp),16度连接O/N,然后取1ul跑胶，9ul转化，没有出来，上胶图。我担心22度是否会破坏T4 ligase的酶活性，我都是在冰上操作，然后移到PCR仪中16度过夜酶切。不过我可以试试22度超24小时。不知道成功率多大，是否有尝试的必要，话说和老板trouble shooting的时候老板很鄙视的说她以前做的时候做了很多平末端连接，弱爆了的感觉啊，毕竟她发过Cell，只能信了啊。
5.是指不用T4 ligase buffer,改用 T4 ligase+Solution I吗？我找找。
6.PEG8000实验室的同学刚分装好，推荐使用，不过他使用来连linker的，做的是大体系的反应，不知道可不可以用来做常规的连接转化实验，是否会对后面的转化有影响。
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11楼2012-04-23 00:42:24
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huguangdong

至尊木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
silicare: 金币+6, BioEPI+1, 应助指数+1, 鼓励深入交流 2012-04-24 10:18:24
引用回帖:
11楼: Originally posted by 320080920001 at 2012-04-23 00:42:24:
1.我是用的easyTaq扩的，不过下次可以尝试用FastPfu,不过T4核苷酸激酶加磷酸基（我们实验室有PNK），你是担心PmlI酶切的片段可能5‘端没有磷酸是吧？
2.我有做vector自连的对照，但目前还没结果，但是就像你第3 ...

1 酶切一般都会有磷酸基，或许是我多疑，但这个酶的酶切效率有多高建议你查一下。
2 连接最好别用PCR仪，况且平末端连接一般都需要16小时以上（经验之谈），废仪器又感觉时间不够。
3 发CELL的人未必做这些实验，只是她那么想而已，想当然的事情不可当真，只有自己做了才知道。
4 Solution I是BUFFER和连接酶的混合体，是改进了的连接液体，连接时只加这个东西，具体加法参照试剂说明书。
5 还有22度连接要加入内切酶，除非你的骨架载体不是酶切形成的。
6 对转化没有任何影响，不过就个人经验来说，PEG的因素不是最主要的，也可以不加。
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12楼2012-04-23 01:19:29
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huguangdong

至尊木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★
320080920001: 金币+1, ★有帮助, 这个确实没经验 2012-04-23 03:48:34
另外告诉你一个经验，普通连接我一般也不用16度，因为这个温度除了TA克隆，其他的效果并不好，一般我都是用4度水浴过夜连接，用PCR仪是太奢侈的做法。
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13楼2012-04-23 01:22:03
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huguangdong

至尊木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★
320080920001: 金币+1, ★有帮助, 感受态是DH5a，是商用的。 2012-04-23 03:48:07
还有一个关键问题就是感受态，自始至终都没听你提到，可能是问题的关键，因为对照都不长东西就很奇怪，一般来说去磷酸化再彻底也会长出自连的菌落，什么都不长一定要排除感受态的问题，建议购买商业化的，比如天根的感受态质量很好。
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14楼2012-04-23 01:24:59
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320080920001

金虫 (正式写手)
引用回帖:
14楼: Originally posted by huguangdong at 2012-04-23 01:24:59:
还有一个关键问题就是感受态，自始至终都没听你提到，可能是问题的关键，因为对照都不长东西就很奇怪，一般来说去磷酸化再彻底也会长出自连的菌落，什么都不长一定要排除感受态的问题，建议购买商业化的，比如天根 ...

感受态细胞我也怀疑过 后来用pUC19做过阳性对照，长出来很多 师兄也说过在4度过夜，我到底是试22度24小时还是4度冰水浴过夜啊？
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15楼2012-04-23 03:47:42
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320080920001

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
silicare: 金币+5, 应助指数+1, 谢谢反馈 2012-04-24 10:19:58
图片中是做了片段和载体PmlI酶切后连接，跑胶的结果，左边的是目的基因的连接结果， 右边两个是从载体切下来的小片段和载体再次连接以及空载体连接。
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16楼2012-04-23 03:56:37
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wanglei512

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
320080920001: 金币+1, ★有帮助 2012-04-28 18:06:24
没看出来KpnI这个点有啥作用，你为啥要用KpnI切，你的目的片段两头既然是PmlI，那么你的骨架两头也应该是PmlI，
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17楼2012-04-23 10:06:26
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cdswd

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
320080920001: 金币+1, ★有帮助, 我试过找粘性末端连接的酶 但是这样的话找到的酶就把载体中的polyA signal给切掉了 没法用啊 2012-04-28 18:07:47
平末端连接不太好做，我之前做过几次才长出了几个菌落，
楼主为什么不重新设计引物呢？用其他酶切位点呀，也许比较平端连接成功的更快呢（要替换的片段上下游有两个PmlI酶切位点，有没有其他的位点呢？建议把载体具体名称说一下，和pEF-GENE是哪个酶切位点间插入了要替换的片段，或者有这个空载体吗？）KpnI是用来干什么的？信息讲的稍微详细一些吧，可以考虑重新定引物
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18楼2012-04-23 10:15:31
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huguangdong

至尊木虫 (职业作家)
引用回帖:
15楼: Originally posted by 320080920001 at 2012-04-23 03:47:42:
感受态细胞我也怀疑过 后来用pUC19做过阳性对照，长出来很多 师兄也说过在4度过夜，我到底是试22度24小时还是4度冰水浴过夜啊？

4度做平末端连接我成功了，但是效率不高，22度是我们实验室其他人得经验，主要是让内切酶起到作用才用这么高的温度，而且连接时间一定要超过24小时，再说一次，如果你的骨架不是平末端内切酶切的就不必要这样做。
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19楼2012-04-23 10:26:53
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AnaSequence

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
silicare: 金币+5, BioEPI+1, 应助指数+1, 鼓励新虫发帖交流 2012-04-24 10:21:02
没叙述清楚,不知道引物F有没有PmeI酶切位点，如果没有，建议还是用高保真酶，免得在其末端引入其他碱基，没得到平末端；载体去磷酸化是必须的。
方案设计不合理，如果下面的改动不影响，试试改一下：
方案1，插入片段不要加PmeI等酶切位点，直接引物磷酸化后高保真酶PCR，连接到PmeI酶切去磷酸化载体，这种情况下，加PmeI才会只切开载体而不是重组质粒，插入片段既然是平末端连接，用的酶又不是常见酶，不如直接高保真PCR得到平末端；
方案2，载体经过PmeI酶切后用聚合酶在末端加T，插入片段用非高保真酶PCR，进行TA克隆。
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20楼2012-04-24 09:14:18
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