应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 平末端连接做不出来克隆
北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
313/4返回列表上一页1234下一页
查看: 5134  |  回复: 30
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
本帖产生 5 个 BioEPI ，点击这里进行查看

320080920001

金虫 (正式写手)
引用回帖:
17楼: Originally posted by wanglei512 at 2012-04-23 10:06:26:
没看出来KpnI这个点有啥作用，你为啥要用KpnI切，你的目的片段两头既然是PmlI，那么你的骨架两头也应该是PmlI，

对啊 我当时做错了 一时糊涂 但是后来只用PmlI切了之后还是没有连接成功
赞一下 回复此楼
21楼2012-04-28 18:06:12
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

320080920001

金虫 (正式写手)
320080920001: 回帖置顶 2012-04-28 19:43:10
前几天和老板一起去苏州听冷泉港亚洲会议去了 没有做实验 现在把载体的图发上来 不过我还是得做平末端连接 不知道怎么办啊 主要是没找到失败原因
赞一下 回复此楼
22楼2012-04-28 18:29:10
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

320080920001

金虫 (正式写手)
320080920001: 回帖置顶 2012-04-28 19:44:58
补图片
赞一下 回复此楼
23楼2012-04-28 19:44:48
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

weigh1111

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

我觉得楼主载体加多了片段加少了~像这种连接的话片段怎么着也该是载体量的5倍以上吧。而且体系可以调到15微升，载体和片段DNA都多加点，比如载体2微升片段7微升这种比例，相应的水少加点。连接是一个概率性的事件，DNA量加大了，出的概率也会更大。平末端连接我觉得16度过夜就差不多了，22度连粘末端没问题，连平端可能稍微嫌高了一点，4度温度太低了酶活性可能不太好。
赞一下 回复此楼
24楼2012-05-07 20:37:23
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

320080920001

金虫 (正式写手)
320080920001: 回帖置顶 2012-05-08 00:09:53
各位好 我的连接做出来了 原因我觉得是T4 ligase buffer的问题，我重新订了一管酶和buffer，连接体系不变，就做出来了，后来16度连接两小时（老板逼的，我是不相信，可是结果让我不得不信了），也出来了。 结果有些戏剧性，不过还是挺感谢那些给出建议和分析的好心人，我也给你人回过贴，知道强忍着分析一个问题的不易，感谢你们，祝大家实验顺利，多发Paper。 有一句话，叫做出来的实验都一样，失败的实验千万种啊！
赞一下 回复此楼
25楼2012-05-08 00:09:44
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

9921218

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
25楼: Originally posted by 320080920001 at 2012-05-08 00:09:44:
各位好 我的连接做出来了 原因我觉得是T4 ligase buffer的问题，我重新订了一管酶和buffer，连接体系不变，就做出来了，后来16度连接两小时（老板逼的，我是不相信，可是结果让我不得不信了），也出来了。 结果有 ...

你好，很关注你的帖子。
我的连接也出状况了
我的载体是EcoRⅤ单酶切 后切胶回收，然后用的CIAP去磷酸化（65℃  30min   试剂盒回收）。目的片段是SacⅡ酶切后，用DNA PolymeraseⅠ切口平移变成平末端。
载体 92ng/ul  目的片段250ng/ul    连接比例做过8:1   10:1  ，16℃水浴锅过夜连接。
转化zeocin平板   什么都不长
我找不到原因了   想问问有什么建议么？
赞一下 回复此楼
七彩泡泡
26楼2012-05-14 19:33:49
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

9921218

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
25楼: Originally posted by 320080920001 at 2012-05-08 00:09:44:
各位好 我的连接做出来了 原因我觉得是T4 ligase buffer的问题，我重新订了一管酶和buffer，连接体系不变，就做出来了，后来16度连接两小时（老板逼的，我是不相信，可是结果让我不得不信了），也出来了。 结果有 ...

你好，很关注你的帖子。
我的连接也出状况了
我的载体是EcoRⅤ单酶切 后切胶回收，然后用的CIAP去磷酸化（65℃  30min   试剂盒回收）。目的片段是SacⅡ酶切后，用DNA PolymeraseⅠ切口平移变成平末端。
载体 92ng/ul  目的片段250ng/ul    连接比例做过8:1   10:1  ，16℃水浴锅过夜连接。
转化zeocin平板   什么都不长
我找不到原因了   想问问有什么建议么？
赞一下 回复此楼
七彩泡泡
27楼2012-05-14 19:34:40
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

320080920001

金虫 (正式写手)
引用回帖:
27楼: Originally posted by 9921218 at 2012-05-14 19:34:40:
你好，很关注你的帖子。
我的连接也出状况了
我的载体是EcoRⅤ单酶切 后切胶回收，然后用的CIAP去磷酸化（65℃  30min   试剂盒回收）。目的片段是SacⅡ酶切后，用DNA PolymeraseⅠ切口平移变成平末端。
载体 ...

我没用过zeocin的板子 不知道有没有确认板子的抗性 还有关于你的连接buffer的使用次数 最好一次化开后分装，每次取一支用，还有你的DNA polymerase I 是带有3‘——5’的外切酶活性吗？这个需要确认一下。每一步实验后要有对照试验。
赞一下 回复此楼
28楼2012-05-14 23:18:58
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

9921218

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
28楼: Originally posted by 320080920001 at 2012-05-14 23:18:58:
我没用过zeocin的板子 不知道有没有确认板子的抗性 还有关于你的连接buffer的使用次数 最好一次化开后分装，每次取一支用，还有你的DNA polymerase I 是带有3‘——5’的外切酶活性吗？这个需要确认一下。每一步实

你好  抗生素的问题可以排除，我做过质粒的转化，长了菌落。我用的连接酶是TKARA的高效连接酶SoutionⅠ，酶和缓冲液是mix的。我的平移活性的酶之前也做过别的连接，也没有问题。
赞一下 回复此楼
七彩泡泡
29楼2012-05-22 10:30:13
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

320080920001

金虫 (正式写手)
引用回帖:
29楼: Originally posted by 9921218 at 2012-05-22 10:30:13:
你好  抗生素的问题可以排除，我做过质粒的转化，长了菌落。我用的连接酶是TKARA的高效连接酶SoutionⅠ，酶和缓冲液是mix的。我的平移活性的酶之前也做过别的连接，也没有问题。

不知道你的Mix是否有问题 我换了buffer就做出来了
赞一下 回复此楼
30楼2012-05-22 19:17:38
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 320080920001 的主题更新
313/4返回列表上一页1234下一页
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 一志愿河北工业大学材料工程，初试344求专硕调剂 +4 15933906766 2026-04-05 4/200 2026-04-06 07:22 by hmn_wj
[考研] 求调剂 +11 熊二想上岸 2026-04-04 11/550 2026-04-05 22:21 by 醉翁wl
[考研] 308求调剂 +4 maverick^_^ 2026-04-03 4/200 2026-04-05 19:08 by 蓝云思雨
[考研] 304求调剂 +3 luoye0105 2026-04-05 3/150 2026-04-05 18:16 by 土木硕士招生
[考研] 求调剂 +3 小沢 2026-04-03 3/150 2026-04-05 09:10 by sihailian3
[考研] 283求调剂 +10 A child 2026-04-04 10/500 2026-04-05 08:22 by qlm5820
[考研] 278求调剂 +3 依旧！ 2026-04-02 4/200 2026-04-04 20:27 by 蓝云思雨
[考研] 319求调剂 +4 星星不眨眼喽 2026-04-03 4/200 2026-04-04 16:25 by 中飞院空管学院�
[考研] 复试调剂 +6 范根培 2026-04-04 6/300 2026-04-04 14:27 by 土木硕士招生
[考研] 土木304求调剂 +4 兔突突突， 2026-03-31 4/200 2026-04-04 13:34 by 1753564080
[考研] 材料295 +13 小英11 2026-04-03 14/700 2026-04-04 09:02 by 来看流星雨10
[考研] 293求调剂 +5 末未mm 2026-04-02 6/300 2026-04-03 15:20 by 王保杰33
[考研] 266求调剂 +3 08电气工程 2026-04-03 3/150 2026-04-03 14:05 by 1753564080
[考研] 285求调剂 +7 AZMK 2026-04-02 9/450 2026-04-03 11:12 by wanwan00
[考研] 283求调剂 +3 jiouuu 2026-04-02 4/200 2026-04-02 14:08 by 哒哒哒呱呱呱
[考研] 一志愿346上海大学生物学 +3 上海大学346调剂 2026-04-01 3/150 2026-04-02 08:36 by w虫虫123
[考研] 310分求调剂 +4 成功上岸wang 2026-04-01 4/200 2026-04-01 20:35 by liu823948201
[考研] 303分 0807学硕求调剂 +3 TYC3632 2026-04-01 3/150 2026-04-01 19:24 by lwk2004
[考研] 求调剂 生物学 377分 +6 zzll03 2026-03-31 6/300 2026-03-31 17:33 by 唐沐儿
[考研] 物理学调剂 +4 小羊36 2026-03-30 4/200 2026-03-31 16:16 by lishahe
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭