应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 平末端连接做不出来克隆
北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
313/4返回列表上一页1234下一页
查看: 5134  |  回复: 30
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
本帖产生 5 个 BioEPI ，点击这里进行查看

320080920001

金虫 (正式写手)
引用回帖:
17楼: Originally posted by wanglei512 at 2012-04-23 10:06:26:
没看出来KpnI这个点有啥作用，你为啥要用KpnI切，你的目的片段两头既然是PmlI，那么你的骨架两头也应该是PmlI，

对啊 我当时做错了 一时糊涂 但是后来只用PmlI切了之后还是没有连接成功
赞一下 回复此楼
21楼2012-04-28 18:06:12
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

320080920001

金虫 (正式写手)
320080920001: 回帖置顶 2012-04-28 19:43:10
前几天和老板一起去苏州听冷泉港亚洲会议去了 没有做实验 现在把载体的图发上来 不过我还是得做平末端连接 不知道怎么办啊 主要是没找到失败原因
赞一下 回复此楼
22楼2012-04-28 18:29:10
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

320080920001

金虫 (正式写手)
320080920001: 回帖置顶 2012-04-28 19:44:58
补图片
赞一下 回复此楼
23楼2012-04-28 19:44:48
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

weigh1111

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

我觉得楼主载体加多了片段加少了~像这种连接的话片段怎么着也该是载体量的5倍以上吧。而且体系可以调到15微升，载体和片段DNA都多加点，比如载体2微升片段7微升这种比例，相应的水少加点。连接是一个概率性的事件，DNA量加大了，出的概率也会更大。平末端连接我觉得16度过夜就差不多了，22度连粘末端没问题，连平端可能稍微嫌高了一点，4度温度太低了酶活性可能不太好。
赞一下 回复此楼
24楼2012-05-07 20:37:23
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

320080920001

金虫 (正式写手)
320080920001: 回帖置顶 2012-05-08 00:09:53
各位好 我的连接做出来了 原因我觉得是T4 ligase buffer的问题，我重新订了一管酶和buffer，连接体系不变，就做出来了，后来16度连接两小时（老板逼的，我是不相信，可是结果让我不得不信了），也出来了。 结果有些戏剧性，不过还是挺感谢那些给出建议和分析的好心人，我也给你人回过贴，知道强忍着分析一个问题的不易，感谢你们，祝大家实验顺利，多发Paper。 有一句话，叫做出来的实验都一样，失败的实验千万种啊！
赞一下 回复此楼
25楼2012-05-08 00:09:44
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

9921218

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
25楼: Originally posted by 320080920001 at 2012-05-08 00:09:44:
各位好 我的连接做出来了 原因我觉得是T4 ligase buffer的问题，我重新订了一管酶和buffer，连接体系不变，就做出来了，后来16度连接两小时（老板逼的，我是不相信，可是结果让我不得不信了），也出来了。 结果有 ...

你好，很关注你的帖子。
我的连接也出状况了
我的载体是EcoRⅤ单酶切 后切胶回收，然后用的CIAP去磷酸化（65℃  30min   试剂盒回收）。目的片段是SacⅡ酶切后，用DNA PolymeraseⅠ切口平移变成平末端。
载体 92ng/ul  目的片段250ng/ul    连接比例做过8:1   10:1  ，16℃水浴锅过夜连接。
转化zeocin平板   什么都不长
我找不到原因了   想问问有什么建议么？
赞一下 回复此楼
七彩泡泡
26楼2012-05-14 19:33:49
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

9921218

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
25楼: Originally posted by 320080920001 at 2012-05-08 00:09:44:
各位好 我的连接做出来了 原因我觉得是T4 ligase buffer的问题，我重新订了一管酶和buffer，连接体系不变，就做出来了，后来16度连接两小时（老板逼的，我是不相信，可是结果让我不得不信了），也出来了。 结果有 ...

你好，很关注你的帖子。
我的连接也出状况了
我的载体是EcoRⅤ单酶切 后切胶回收，然后用的CIAP去磷酸化（65℃  30min   试剂盒回收）。目的片段是SacⅡ酶切后，用DNA PolymeraseⅠ切口平移变成平末端。
载体 92ng/ul  目的片段250ng/ul    连接比例做过8:1   10:1  ，16℃水浴锅过夜连接。
转化zeocin平板   什么都不长
我找不到原因了   想问问有什么建议么？
赞一下 回复此楼
七彩泡泡
27楼2012-05-14 19:34:40
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

320080920001

金虫 (正式写手)
引用回帖:
27楼: Originally posted by 9921218 at 2012-05-14 19:34:40:
你好，很关注你的帖子。
我的连接也出状况了
我的载体是EcoRⅤ单酶切 后切胶回收，然后用的CIAP去磷酸化（65℃  30min   试剂盒回收）。目的片段是SacⅡ酶切后，用DNA PolymeraseⅠ切口平移变成平末端。
载体 ...

我没用过zeocin的板子 不知道有没有确认板子的抗性 还有关于你的连接buffer的使用次数 最好一次化开后分装，每次取一支用，还有你的DNA polymerase I 是带有3‘——5’的外切酶活性吗？这个需要确认一下。每一步实验后要有对照试验。
赞一下 回复此楼
28楼2012-05-14 23:18:58
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

9921218

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
28楼: Originally posted by 320080920001 at 2012-05-14 23:18:58:
我没用过zeocin的板子 不知道有没有确认板子的抗性 还有关于你的连接buffer的使用次数 最好一次化开后分装，每次取一支用，还有你的DNA polymerase I 是带有3‘——5’的外切酶活性吗？这个需要确认一下。每一步实

你好  抗生素的问题可以排除，我做过质粒的转化，长了菌落。我用的连接酶是TKARA的高效连接酶SoutionⅠ，酶和缓冲液是mix的。我的平移活性的酶之前也做过别的连接，也没有问题。
赞一下 回复此楼
七彩泡泡
29楼2012-05-22 10:30:13
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

320080920001

金虫 (正式写手)
引用回帖:
29楼: Originally posted by 9921218 at 2012-05-22 10:30:13:
你好  抗生素的问题可以排除，我做过质粒的转化，长了菌落。我用的连接酶是TKARA的高效连接酶SoutionⅠ，酶和缓冲液是mix的。我的平移活性的酶之前也做过别的连接，也没有问题。

不知道你的Mix是否有问题 我换了buffer就做出来了
赞一下 回复此楼
30楼2012-05-22 19:17:38
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 320080920001 的主题更新
313/4返回列表上一页1234下一页
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 284求调剂 +7 徐同学_001 2026-04-04 13/650 2026-04-05 17:19 by yulian1987
[考研] 306分材料与化工求调剂 +7 黎吧啦啦你很有� 2026-04-03 7/350 2026-04-05 17:18 by Hdyxbekcb
[考研] 282求调剂 +3 aaa车辆 2026-04-01 3/150 2026-04-05 17:03 by yulian1987
[考研] 359求调剂22408 +3 123456789qw 2026-03-31 3/150 2026-04-05 10:09 by zhq0425
[考研] 材料求调剂 +10 呢呢妮妮 2026-04-01 10/500 2026-04-04 23:12 by 无际的草原
[考研] 材料专硕306英一数二 +8 z1z2z3879 2026-03-31 8/400 2026-04-04 22:08 by hemengdong
[考研] 求调剂 +4 晟功? 2026-04-03 4/200 2026-04-04 21:58 by hemengdong
[考研] 283求调剂 +4 mcbbc 2026-04-03 5/250 2026-04-04 20:51 by imissbao
[考研] 一志愿武理材料工程302调剂环化或化工 +19 Doleres 2026-03-31 20/1000 2026-04-04 16:44 by 啊俊！
[考研] 数二英二348求调剂 +4 hxdzj1 2026-04-03 5/250 2026-04-03 21:25 by zhq0425
[考研] 289-求调剂 +4 这里是_ 2026-04-03 4/200 2026-04-03 14:23 by 1753564080
[考研] 266求调剂 +3 08电气工程 2026-04-03 3/150 2026-04-03 14:05 by 1753564080
[考研] 一志愿华东理工大学，080500学硕，317分，求调剂 +13 s1145 2026-03-31 15/750 2026-04-03 11:44 by msi123
[考研] 312 化工或制药调剂 +8 小小墨123 2026-04-02 9/450 2026-04-03 09:12 by zhouxiaoyu
[考研] 一志愿a区211，085601-307分求调剂 +13 党嘉豪 2026-03-31 26/1300 2026-04-03 08:33 by 495374996
[考研] 312求调剂 +4 赊月色 2026-04-02 5/250 2026-04-03 08:21 by fangshan711
[考研] 一志愿厦门大学化学工程（专硕）-数二英二406分-求调剂 +5 厦大化工 2026-04-01 5/250 2026-04-02 10:03 by jp9609
[考研] 311求调剂 +10 李芷新1 2026-03-31 10/500 2026-04-01 14:38 by chenqifeng666
[硕博家园] 考研调剂 +5 骆驼男人 2026-04-01 5/250 2026-04-01 14:28 by syjjj0321
[考研] 一志愿浙江大学工科动力工程370,数一121,专业课135，现在能去哪里 +3 080700调剂 2026-03-30 4/200 2026-03-31 12:00 by KLMY666
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭