17楼: Originally posted by wanglei512 at 2012-04-23 10:06:26:
没看出来KpnI这个点有啥作用，你为啥要用KpnI切，你的目的片段两头既然是PmlI，那么你的骨架两头也应该是PmlI，

25楼: Originally posted by 320080920001 at 2012-05-08 00:09:44:
各位好 我的连接做出来了 原因我觉得是T4 ligase buffer的问题，我重新订了一管酶和buffer，连接体系不变，就做出来了，后来16度连接两小时（老板逼的，我是不相信，可是结果让我不得不信了），也出来了。 结果有 ...

25楼: Originally posted by 320080920001 at 2012-05-08 00:09:44:
各位好 我的连接做出来了 原因我觉得是T4 ligase buffer的问题，我重新订了一管酶和buffer，连接体系不变，就做出来了，后来16度连接两小时（老板逼的，我是不相信，可是结果让我不得不信了），也出来了。 结果有 ...

27楼: Originally posted by 9921218 at 2012-05-14 19:34:40:
你好，很关注你的帖子。
我的连接也出状况了
我的载体是EcoRⅤ单酶切 后切胶回收，然后用的CIAP去磷酸化（65℃  30min   试剂盒回收）。目的片段是SacⅡ酶切后，用DNA PolymeraseⅠ切口平移变成平末端。
载体 ...

28楼: Originally posted by 320080920001 at 2012-05-14 23:18:58:
我没用过zeocin的板子 不知道有没有确认板子的抗性 还有关于你的连接buffer的使用次数 最好一次化开后分装，每次取一支用，还有你的DNA polymerase I 是带有3‘——5’的外切酶活性吗？这个需要确认一下。每一步实

29楼: Originally posted by 9921218 at 2012-05-22 10:30:13:
你好  抗生素的问题可以排除，我做过质粒的转化，长了菌落。我用的连接酶是TKARA的高效连接酶SoutionⅠ，酶和缓冲液是mix的。我的平移活性的酶之前也做过别的连接，也没有问题。