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320080920001金虫 (正式写手)
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[求助]
平末端连接做不出来克隆
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大家好，我最近在做克隆，是把我以前做过的一个基因的点突变后的质粒（pFastbac1-GENE）设计引物（F和R，在R引物上带有PmlI的酶切位点，F和R内侧附近分别有PmlI和KpnI位点，均为单酶切位点），PCR完了后溶液回收Kit回收，浓度大概130ng/ul,70ul elute，之后我用PmlI和KpnI切（此处犯了一个错误，应该只用PmlI切，这样就不用后面切平了），然后跑胶，切胶回收，用的是Qiagen的胶回收试剂盒，浓度大概为30ng/ul,50ul eltue,而且260/230的值不到0.1，很低。然后用Klenow酶（large fragment）切平KpnI的位点，然后溶液回收。我把pEF-GENE用PmlI酶切（在我要替换的片段上下游有两个PmlI酶切位点），跑胶回收vector，浓度是60ng/ul。用CIP酶处理后消除5‘磷酸，防止自连。然后溶液回收。 最后用T4liase把insert和vector连接起来，转化涂板，我试过DH5a和T1，都没有长出来，这个质粒要的很急，最近我也快做完毕业设计回去答辩了，由于最后这个实验不顺利，我都不知道老板会不会要我，虽然我很想留在她的实验室。最近给自己的压力好大啊！ P.S.求技术指导，关心酱油之类的回帖不回勿怪哈！我后面有用pEF-GENE为模板做点突变PCR，但是由于片段是9KB左右，很难P出来。还在平行做PCR后用PmlI单酶切，这样就不用连接了，还在想要不要再设计一下引物，就在紧挨片段上下游，再做PCR，这样酶切后就不用胶回收，直接溶液回收了。 |
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【答案】应助回帖
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silicare: 金币+6, BioEPI+1, 应助指数+1, 鼓励深入交流 2012-04-24 10:18:24
silicare: 金币+6, BioEPI+1, 应助指数+1, 鼓励深入交流 2012-04-24 10:18:24
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1 酶切一般都会有磷酸基，或许是我多疑，但这个酶的酶切效率有多高建议你查一下。 2 连接最好别用PCR仪，况且平末端连接一般都需要16小时以上（经验之谈），废仪器又感觉时间不够。 3 发CELL的人未必做这些实验，只是她那么想而已，想当然的事情不可当真，只有自己做了才知道。 4 Solution I是BUFFER和连接酶的混合体，是改进了的连接液体，连接时只加这个东西，具体加法参照试剂说明书。 5 还有22度连接要加入内切酶，除非你的骨架载体不是酶切形成的。 6 对转化没有任何影响，不过就个人经验来说，PEG的因素不是最主要的，也可以不加。 |
12楼2012-04-23 01:19:29
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