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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 酶切酶连转化
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郝连芷水

木虫 (小有名气)

[求助] 酶切酶连转化

各位，请教个问题。
我需要重组构建个质粒，要将A质粒的7kb片段PCR出来（KOD酶），B质粒的1.7kb片段PCR出来（Pfu酶），然后再进行双酶切，酶连，转化（没有好的酶切位点，只有P出来）。
现在遇到的问题是P出来的非特异带很多，目的带回收后浓度非常低15ng/µl（100µl体系），而且目的条带有时有有时没有。然后我还要酶切，再回收，几乎就没有了，然后转感受态，做了n批，都没有阳性克隆，不知道问题出在哪里。求教如何改善？
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1楼 2011-12-25 20:42:23
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分子实验哥

捐助贵宾 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
西瓜(金币+1): 鼓励应助 2011-12-26 11:39:36
片段太短   最好用巢式PCR   这样特异性应该会高点
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2楼2011-12-25 22:15:29
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imyting

至尊木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
西瓜(金币+1): 鼓励交流 2011-12-26 11:40:18
切胶回收来的可以再进行PCR，扩大量，切胶回收来的那一部分可以直接作为模板保存
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悠哉游哉做实验，成兮败兮我随便
3楼2011-12-26 09:36:19
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郝连芷水

木虫 (小有名气)
引用回帖:
楼: Originally posted by imyting at 2011-12-26 09:36:19:
切胶回收来的可以再进行PCR，扩大量，切胶回收来的那一部分可以直接作为模板保存

大哥，我也这么做过了，可是我发现效果还是差不多，有时候还没直接拿质粒p的效果好。
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4楼2011-12-26 11:15:13
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西瓜

荣誉版主 (知名作家)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
wanhscn(金币+2): 鼓励应助 2011-12-26 12:03:21
引用回帖:
4楼: Originally posted by 郝连芷水 at 2011-12-26 11:15:13:
大哥，我也这么做过了，可是我发现效果还是差不多，有时候还没直接拿质粒p的效果好。

可以试试2楼说的巢式PCR。用第一次PCR时引物往外设计，以第一次的产物作为模板，第二次PCR时再扩增出所需的片段。具体可以搜下巢式PCR的原理。
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5楼2011-12-26 11:42:01
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yuandian114

银虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西瓜(金币+2): 鼓励应助，确实可行哈 2011-12-26 15:32:24
切胶回收，将胶回收的PCR产物直接作为模板再做PCR，不过能这里头有个小技巧lz可以参考一下，就是讲退火温度提高，这个经过我自己验证了N次，绝对可以减少非特异性条带，哈哈，希望对lz有帮助，也希望lz实验顺利
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6楼2011-12-26 13:48:15
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tianhuijuan

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
wanhscn(金币+2): 鼓励交流应助！ 2011-12-27 20:19:14
切胶回收PCR产物作模板，进行二次PCR，会将第一次PCR中少量非特异性产物大量扩增，所以特异性会更差。
二次PCR和巢式PCR区别很大。
6楼说的妙计未曾尝试过，可以小试一下。
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7楼2011-12-26 21:18:04
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gjs713

至尊木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
摸索一下退火温度吧，这个很关键的。可以做个退火温度梯度。
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勤奋、执着、专注，则无坚不破。
8楼2011-12-27 12:39:19
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panda73

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
wanhscn(金币+1): 鼓励应助 2011-12-27 20:19:46
1.引物设计很重要，如果你知道需要扩增的全序列，建议你利用软件提高引物的特异性
2.上下游引物的退火温度尽量接近（1-2度范围内，我建议你直接设计退火温度为72的引物）
3.从72度开始，向60度设计两三个温度梯度，应该能解决特异性和产量的问题
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9楼2011-12-27 12:48:54
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笑笑2697

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
wanhscn(金币+3): 鼓励新虫友回帖应助，再接再励！ 2011-12-27 20:20:14
无阳性克隆就是未连接成功，主要原因就是说目的基因少。可以重新考虑设计引物，或第一次PCR产物纯化后以此纯化产物为模板继续PCR。
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10楼2011-12-27 14:46:24
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