应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 酶切酶连转化
51/1返回列表
查看: 3523  |  回复: 11
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

郝连芷水

木虫 (小有名气)

[求助] 酶切酶连转化

各位，请教个问题。
我需要重组构建个质粒，要将A质粒的7kb片段PCR出来（KOD酶），B质粒的1.7kb片段PCR出来（Pfu酶），然后再进行双酶切，酶连，转化（没有好的酶切位点，只有P出来）。
现在遇到的问题是P出来的非特异带很多，目的带回收后浓度非常低15ng/µl（100µl体系），而且目的条带有时有有时没有。然后我还要酶切，再回收，几乎就没有了，然后转感受态，做了n批，都没有阳性克隆，不知道问题出在哪里。求教如何改善？
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2011-12-25 20:42:23
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

郝连芷水

木虫 (小有名气)
引用回帖:
楼: Originally posted by imyting at 2011-12-26 09:36:19:
切胶回收来的可以再进行PCR，扩大量，切胶回收来的那一部分可以直接作为模板保存

大哥，我也这么做过了，可是我发现效果还是差不多，有时候还没直接拿质粒p的效果好。
赞一下 回复此楼
4楼2011-12-26 11:15:13
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 12 个回答

分子实验哥

捐助贵宾 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
西瓜(金币+1): 鼓励应助 2011-12-26 11:39:36
片段太短   最好用巢式PCR   这样特异性应该会高点
赞一下(1人) 回复此楼
2楼2011-12-25 22:15:29
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

imyting

至尊木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
西瓜(金币+1): 鼓励交流 2011-12-26 11:40:18
切胶回收来的可以再进行PCR，扩大量，切胶回收来的那一部分可以直接作为模板保存
赞一下(1人) 回复此楼
悠哉游哉做实验，成兮败兮我随便
3楼2011-12-26 09:36:19
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

西瓜

荣誉版主 (知名作家)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
wanhscn(金币+2): 鼓励应助 2011-12-26 12:03:21
引用回帖:
4楼: Originally posted by 郝连芷水 at 2011-12-26 11:15:13:
大哥，我也这么做过了，可是我发现效果还是差不多，有时候还没直接拿质粒p的效果好。

可以试试2楼说的巢式PCR。用第一次PCR时引物往外设计，以第一次的产物作为模板，第二次PCR时再扩增出所需的片段。具体可以搜下巢式PCR的原理。
赞一下(1人) 回复此楼
5楼2011-12-26 11:42:01
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 12 个回答
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[论文投稿] 售一区SCI文章T0P，我:8O.551.O54,科目全,可十急 +3 k0dTPqJtl0jt 2026-08-14 5/250 2026-08-15 15:10 by QXtWNz7PI7wZ
[基金申请] 时间戳又变了8-15 +7 archvillain 2026-08-15 11/550 2026-08-15 15:06 by Yeuchan
[基金申请] 有时候，自然基金真的不能太认真 （我的申报经验） +7 majunge000 2026-08-11 9/450 2026-08-15 13:34 by kiz2011
[博后之家] 售SCI文章，我:8O.5.5.1O.54,科目全,可十急 +3 k0dTPqJtl0jt 2026-08-14 3/150 2026-08-15 12:41 by KxMI1BYBxWX1
[基金申请] 关于Filecode分析方法 +10 majunge000 2026-08-10 13/650 2026-08-15 12:26 by hanpeng972
[考研] 售SCI文章，我:8O5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +4 7lpolszZVXgi 2026-08-14 8/400 2026-08-15 11:53 by KxMI1BYBxWX1
[考博] 售一区SCI文章T0P，我:8O.551.O54,科目全,可十急 +3 HFw0lei2R37i 2026-08-14 5/250 2026-08-15 11:41 by KxMI1BYBxWX1
[考博] 售SCI文章，我:8O.5.5.1O.54,科目全,可十急 +4 k0dTPqJtl0jt 2026-08-14 5/250 2026-08-15 04:45 by 4wMiSEwB6436
[公派出国] 售SCI一区T0P文章，我:8.O55.1.O.54,科目全,可十急 +3 7lpolszZVXgi 2026-08-14 5/250 2026-08-15 04:41 by 4wMiSEwB6436
[找工作] 售SCI文章，我:8O5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +4 k0dTPqJtl0jt 2026-08-14 4/200 2026-08-15 02:21 by 4wMiSEwB6436
[基金申请] 各位道友，我要去昆明玩几天，回来见。 +7 Tide man 2026-08-14 8/400 2026-08-15 01:11 by arzu_hma
[基金申请] 是这周出结果还是下周出结果？ +4 yuleib84 2026-08-11 4/200 2026-08-14 23:05 by lfy8008
[基金申请] 应该是93bebmhtak前后十一个字符比较关键 +23 Lanmanbaby 2026-08-09 37/1850 2026-08-14 13:40 by Equinoxhua
[基金申请] filecode +15 documentary 2026-08-10 17/850 2026-08-14 10:08 by kissu88
[基金申请] FileCode能看出啥？ +10 要乐观耀哥 2026-08-10 32/1600 2026-08-14 09:37 by 要乐观耀哥
[文学芳草园] 阿姨 +4 汪汪锅 2026-08-09 4/200 2026-08-13 19:43 by arzu_hma
[基金申请] 静等基金结果 +8 gjjjzhong 2026-08-10 21/1050 2026-08-13 17:56 by 且听虎啸
[基金申请] 2019年青年基金涵评意见，大家看看几个A，几个B? +11 Tide man 2026-08-11 11/550 2026-08-13 07:35 by 撸猫猫
[基金申请] 据悉今年马上要出结果了 +7 瞬息宇宙 2026-08-10 8/400 2026-08-10 12:42 by Vivilian
[基金申请] 面上项目filecode邪修 +5 西山十月 2026-08-09 7/350 2026-08-10 07:32 by 仁砚薪传
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭