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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 【求助/交流】酶连转化
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tangchaoxi

新虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】酶连转化

我将载体和片段分别用同样的两个酶双酶切后酶连，转化子提质粒酶切验证，结果只有一个条带，大概载体那么大，怀疑是不是载体自连了？如果是的话，我如何避免载体自连，把我的目的片段连上去呢？请各位帮帮忙…
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1楼2011-03-24 11:13:38
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gongeleven

铁杆木虫 (正式写手)
tangchaoxi(金币+1): 2011-03-24 15:32:38
载体酶切后加CIP处理
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2楼2011-03-24 11:59:39
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wqj1988926

金虫 (正式写手)
对连接产物筛选，一般不是都有一些抗性基因连接后表达之类的，
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3楼2011-03-24 12:55:58
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whyann

银虫 (初入文坛)
tangchaoxi(金币+2): 2011-03-24 15:30:25
既然是双酶切，产生的应该是不同的粘性末端，怎么会自连，应该是其他问题，楼主好好回忆每步
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4楼2011-03-24 13:13:53
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yabxxh

木虫 (正式写手)
tangchaoxi(金币+3): 2011-03-24 15:26:27
这个的话建议酶切时间在四个小时以上，以保证酶切的彻底，另外你的目的片段浓度要足够的高，最关键的就是载体和目的片段的比例了，我一般是用肉眼观察，然后决定二者的用量，当然还有极端派会去测od，然后算出精确地比例，载体和插入片段的mol比最好是2:7，还有就是连接时间了，快速的话要半个小时，一般的要过夜，做到以上几点，应该会没有自连了，其实自连还是酶切不够彻底，因为你是粘性末端，应该很好做的，好运
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5楼2011-03-24 14:03:39
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tangchaoxi

新虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by yabxxh at 2011-03-24 14:03:39:
这个的话建议酶切时间在四个小时以上，以保证酶切的彻底，另外你的目的片段浓度要足够的高，最关键的就是载体和目的片段的比例了，我一般是用肉眼观察，然后决定二者的用量，当然还有极端派会去测od，然后算出精确 ...

谢谢！还想问下，酶切不彻底是指我验证时候酶切不彻底还是我连接之前酶切不彻底？楼上有位虫友说双酶切不会自连，那就是我验证时候酶切有问题？
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6楼2011-03-24 15:30:08
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tangchaoxi

新虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by whyann at 2011-03-24 13:13:53:
既然是双酶切，产生的应该是不同的粘性末端，怎么会自连，应该是其他问题，楼主好好回忆每步

谢谢！如果不是自连，那肯定是连上目的片段了，因为载体有抗性啊，没连上的话是不会转化出来的对吗？
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7楼2011-03-24 15:31:51
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tangchaoxi

新虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by gongeleven at 2011-03-24 11:59:39:
载体酶切后加CIP处理

CIP是什么东东？
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8楼2011-03-24 15:32:56
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yabxxh

木虫 (正式写手)
tangchaoxi(金币+2): 2011-03-24 16:52:26
引用回帖:
Originally posted by yabxxh at 2011-03-24 14:03:39:
这个的话建议酶切时间在四个小时以上，以保证酶切的彻底，另外你的目的片段浓度要足够的高，最关键的就是载体和目的片段的比例了，我一般是用肉眼观察，然后决定二者的用量，当然还有极端派会去测od，然后算出精确 ...

我的意思是你连接之前的酶切要彻底，另外，做一个对照，转个质粒，看看感受态有没有问题。
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9楼2011-03-24 15:44:27
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tangchaoxi

新虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by yabxxh at 2011-03-24 15:44:27:
我的意思是你连接之前的酶切要彻底，另外，做一个对照，转个质粒，看看感受态有没有问题。

连接之前酶切怎么验证呢？片段很小很小，电泳无法检测。
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10楼2011-03-24 16:54:29
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rioarsenal

金虫 (正式写手)
tangchaoxi(金币+1): 2011-03-25 08:47:30
感觉像没有切开吧，呵呵~
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11楼2011-03-24 16:55:38
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yabxxh

木虫 (正式写手)
tangchaoxi(金币+1): 2011-03-25 08:48:14
无法验证，只能按照内切酶的说明书酶切相应时间以上，以前用国内的酶我一般过夜，现在用Fermentas的快速内切酶，一个小时就够了
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12楼2011-03-24 16:58:59
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tangchaoxi

新虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by rioarsenal at 2011-03-24 16:55:38:
感觉像没有切开吧，呵呵~

是连接前没有切开吗？
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13楼2011-03-25 08:48:04
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tangchaoxi

新虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by yabxxh at 2011-03-24 16:58:59:
无法验证，只能按照内切酶的说明书酶切相应时间以上，以前用国内的酶我一般过夜，现在用Fermentas的快速内切酶，一个小时就够了

我用的是NEB的酶，酶切4个小时。
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14楼2011-03-25 08:49:53
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rioarsenal

金虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
引用回帖:
Originally posted by tangchaoxi at 2011-03-25 08:48:04:
是连接前没有切开吗？

是啊，建议你酶切后，做个电泳看看是否切开
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15楼2011-03-25 10:27:14
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tangchaoxi

新虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by rioarsenal at 2011-03-25 10:27:14:
是啊，建议你酶切后，做个电泳看看是否切开

没有办法检测的，切下的片段很小
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16楼2011-03-25 11:38:18
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rioarsenal

金虫 (正式写手)
★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
看天(金币+2): 鼓励交流 2011-03-25 22:57:38
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Originally posted by tangchaoxi at 2011-03-25 11:38:18:
没有办法检测的，切下的片段很小

基因片段是检测不了，一般酶切也没啥问题。载体是可以检测的，酶切后，载体超螺旋和开环的带都应该消失，只有线状的带；酶切之前，应该是三条带。
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17楼2011-03-25 17:21:39
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tangchaoxi

新虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by rioarsenal at 2011-03-25 17:21:39:
基因片段是检测不了，一般酶切也没啥问题。载体是可以检测的，酶切后，载体超螺旋和开环的带都应该消失，只有线状的带；酶切之前，应该是三条带。

非常感谢，这倒提醒我了。我是跟别人拿的质粒转到大肠杆菌，再提出来以备后用，当时提出来检测结果是一条带，别人的是三条带。因为这个载体有抗性，所以当时觉得转化子肯定没问题。质粒非得有三条带吗？
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18楼2011-03-25 21:48:25
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tangchaoxi

新虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by rioarsenal at 2011-03-25 17:21:39:
基因片段是检测不了，一般酶切也没啥问题。载体是可以检测的，酶切后，载体超螺旋和开环的带都应该消失，只有线状的带；酶切之前，应该是三条带。

怎么没消息了呢
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19楼2011-03-28 09:18:25
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rioarsenal

金虫 (正式写手)
★
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Originally posted by tangchaoxi at 2011-03-25 21:48:25:
非常感谢，这倒提醒我了。我是跟别人拿的质粒转到大肠杆菌，再提出来以备后用，当时提出来检测结果是一条带，别人的是三条带。因为这个载体有抗性，所以当时觉得转化子肯定没问题。质粒非得有三条带吗？

质粒也不都是三条带，但是酶切后肯定质粒，应该与原来的质粒电泳图不一样
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20楼2011-03-28 09:55:19
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rioarsenal

金虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by tangchaoxi at 2011-03-28 09:18:25:
怎么没消息了呢

你电泳做了么？
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21楼2011-03-28 09:55:49
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zgb1982

木虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
连接片段那么小，载体又那么大，酶切应该看不出来的。不如直接测序吧，最可靠。
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22楼2011-03-28 10:04:52
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tangchaoxi

新虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by rioarsenal at 2011-03-28 09:55:49:
你电泳做了么？

做了，现在确定连接之前切开了，为什么对转化子酶切验证不出来呢
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23楼2011-03-28 13:30:07
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zmw_520

禁虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
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24楼2011-03-28 19:54:54
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tangchaoxi

新虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by zmw_520 at 2011-03-28 19:54:54:
是碱性磷酸酶，去磷酸化用的，但是你是双酶切，应该用不着~~~

哦，同样感谢！
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25楼2011-03-29 09:19:36
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