应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 【求助/交流】酶连转化
251/1返回列表
查看: 2574  |  回复: 24
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

tangchaoxi

新虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】酶连转化

我将载体和片段分别用同样的两个酶双酶切后酶连，转化子提质粒酶切验证，结果只有一个条带，大概载体那么大，怀疑是不是载体自连了？如果是的话，我如何避免载体自连，把我的目的片段连上去呢？请各位帮帮忙…
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:

» 抢金币啦！回帖就可以得到:

查看全部散金贴
1楼 2011-03-24 11:13:38
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

gongeleven

铁杆木虫 (正式写手)
tangchaoxi(金币+1): 2011-03-24 15:32:38
载体酶切后加CIP处理
赞一下 回复此楼
2楼2011-03-24 11:59:39
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

wqj1988926

金虫 (正式写手)
对连接产物筛选，一般不是都有一些抗性基因连接后表达之类的，
赞一下 回复此楼
3楼2011-03-24 12:55:58
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

whyann

银虫 (初入文坛)
tangchaoxi(金币+2): 2011-03-24 15:30:25
既然是双酶切，产生的应该是不同的粘性末端，怎么会自连，应该是其他问题，楼主好好回忆每步
赞一下 回复此楼
4楼2011-03-24 13:13:53
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

yabxxh

木虫 (正式写手)
tangchaoxi(金币+3): 2011-03-24 15:26:27
这个的话建议酶切时间在四个小时以上，以保证酶切的彻底，另外你的目的片段浓度要足够的高，最关键的就是载体和目的片段的比例了，我一般是用肉眼观察，然后决定二者的用量，当然还有极端派会去测od，然后算出精确地比例，载体和插入片段的mol比最好是2:7，还有就是连接时间了，快速的话要半个小时，一般的要过夜，做到以上几点，应该会没有自连了，其实自连还是酶切不够彻底，因为你是粘性末端，应该很好做的，好运
赞一下 回复此楼
5楼2011-03-24 14:03:39
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

tangchaoxi

新虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by yabxxh at 2011-03-24 14:03:39:
这个的话建议酶切时间在四个小时以上，以保证酶切的彻底，另外你的目的片段浓度要足够的高，最关键的就是载体和目的片段的比例了，我一般是用肉眼观察，然后决定二者的用量，当然还有极端派会去测od，然后算出精确 ...

谢谢！还想问下，酶切不彻底是指我验证时候酶切不彻底还是我连接之前酶切不彻底？楼上有位虫友说双酶切不会自连，那就是我验证时候酶切有问题？
赞一下 回复此楼
6楼2011-03-24 15:30:08
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

tangchaoxi

新虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by whyann at 2011-03-24 13:13:53:
既然是双酶切，产生的应该是不同的粘性末端，怎么会自连，应该是其他问题，楼主好好回忆每步

谢谢！如果不是自连，那肯定是连上目的片段了，因为载体有抗性啊，没连上的话是不会转化出来的对吗？
赞一下 回复此楼
7楼2011-03-24 15:31:51
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

tangchaoxi

新虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by gongeleven at 2011-03-24 11:59:39:
载体酶切后加CIP处理

CIP是什么东东？
赞一下 回复此楼
8楼2011-03-24 15:32:56
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

yabxxh

木虫 (正式写手)
tangchaoxi(金币+2): 2011-03-24 16:52:26
引用回帖:
Originally posted by yabxxh at 2011-03-24 14:03:39:
这个的话建议酶切时间在四个小时以上，以保证酶切的彻底，另外你的目的片段浓度要足够的高，最关键的就是载体和目的片段的比例了，我一般是用肉眼观察，然后决定二者的用量，当然还有极端派会去测od，然后算出精确 ...

我的意思是你连接之前的酶切要彻底，另外，做一个对照，转个质粒，看看感受态有没有问题。
赞一下 回复此楼
9楼2011-03-24 15:44:27
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

tangchaoxi

新虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by yabxxh at 2011-03-24 15:44:27:
我的意思是你连接之前的酶切要彻底，另外，做一个对照，转个质粒，看看感受态有没有问题。

连接之前酶切怎么验证呢？片段很小很小，电泳无法检测。
赞一下 回复此楼
10楼2011-03-24 16:54:29
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

rioarsenal

金虫 (正式写手)
tangchaoxi(金币+1): 2011-03-25 08:47:30
感觉像没有切开吧，呵呵~
赞一下 回复此楼
11楼2011-03-24 16:55:38
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

yabxxh

木虫 (正式写手)
tangchaoxi(金币+1): 2011-03-25 08:48:14
无法验证，只能按照内切酶的说明书酶切相应时间以上，以前用国内的酶我一般过夜，现在用Fermentas的快速内切酶，一个小时就够了
赞一下 回复此楼
12楼2011-03-24 16:58:59
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

tangchaoxi

新虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by rioarsenal at 2011-03-24 16:55:38:
感觉像没有切开吧，呵呵~

是连接前没有切开吗？
赞一下 回复此楼
13楼2011-03-25 08:48:04
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

tangchaoxi

新虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by yabxxh at 2011-03-24 16:58:59:
无法验证，只能按照内切酶的说明书酶切相应时间以上，以前用国内的酶我一般过夜，现在用Fermentas的快速内切酶，一个小时就够了

我用的是NEB的酶，酶切4个小时。
赞一下 回复此楼
14楼2011-03-25 08:49:53
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

rioarsenal

金虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
引用回帖:
Originally posted by tangchaoxi at 2011-03-25 08:48:04:
是连接前没有切开吗？

是啊，建议你酶切后，做个电泳看看是否切开
赞一下(1人) 回复此楼
15楼2011-03-25 10:27:14
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

tangchaoxi

新虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by rioarsenal at 2011-03-25 10:27:14:
是啊，建议你酶切后，做个电泳看看是否切开

没有办法检测的，切下的片段很小
赞一下 回复此楼
16楼2011-03-25 11:38:18
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

rioarsenal

金虫 (正式写手)
★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
看天(金币+2): 鼓励交流 2011-03-25 22:57:38
引用回帖:
Originally posted by tangchaoxi at 2011-03-25 11:38:18:
没有办法检测的，切下的片段很小

基因片段是检测不了，一般酶切也没啥问题。载体是可以检测的，酶切后，载体超螺旋和开环的带都应该消失，只有线状的带；酶切之前，应该是三条带。
赞一下(2人) 回复此楼
17楼2011-03-25 17:21:39
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

tangchaoxi

新虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by rioarsenal at 2011-03-25 17:21:39:
基因片段是检测不了，一般酶切也没啥问题。载体是可以检测的，酶切后，载体超螺旋和开环的带都应该消失，只有线状的带；酶切之前，应该是三条带。

非常感谢，这倒提醒我了。我是跟别人拿的质粒转到大肠杆菌，再提出来以备后用，当时提出来检测结果是一条带，别人的是三条带。因为这个载体有抗性，所以当时觉得转化子肯定没问题。质粒非得有三条带吗？
赞一下 回复此楼
18楼2011-03-25 21:48:25
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

tangchaoxi

新虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by rioarsenal at 2011-03-25 17:21:39:
基因片段是检测不了，一般酶切也没啥问题。载体是可以检测的，酶切后，载体超螺旋和开环的带都应该消失，只有线状的带；酶切之前，应该是三条带。

怎么没消息了呢
回复此楼
19楼2011-03-28 09:18:25
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

rioarsenal

金虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
引用回帖:
Originally posted by tangchaoxi at 2011-03-25 21:48:25:
非常感谢，这倒提醒我了。我是跟别人拿的质粒转到大肠杆菌，再提出来以备后用，当时提出来检测结果是一条带，别人的是三条带。因为这个载体有抗性，所以当时觉得转化子肯定没问题。质粒非得有三条带吗？

质粒也不都是三条带，但是酶切后肯定质粒，应该与原来的质粒电泳图不一样
赞一下(1人) 回复此楼
20楼2011-03-28 09:55:19
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

rioarsenal

金虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by tangchaoxi at 2011-03-28 09:18:25:
怎么没消息了呢

你电泳做了么？
回复此楼
21楼2011-03-28 09:55:49
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

zgb1982

木虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
连接片段那么小，载体又那么大，酶切应该看不出来的。不如直接测序吧，最可靠。
赞一下(1人) 回复此楼
22楼2011-03-28 10:04:52
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

tangchaoxi

新虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by rioarsenal at 2011-03-28 09:55:49:
你电泳做了么？

做了，现在确定连接之前切开了，为什么对转化子酶切验证不出来呢
赞一下 回复此楼
23楼2011-03-28 13:30:07
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

zmw_520

禁虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
本帖内容被屏蔽
24楼2011-03-28 19:54:54
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

tangchaoxi

新虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by zmw_520 at 2011-03-28 19:54:54:
是碱性磷酸酶，去磷酸化用的，但是你是双酶切，应该用不着~~~

哦，同样感谢！
回复此楼
25楼2011-03-29 09:19:36
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 tangchaoxi 的主题更新
251/1返回列表
普通表情 龙 兔 虎 猫 高级回复 (可上传附件)
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 081700 调剂 267分 +10 迷人的哈哈 2026-03-23 10/500 2026-03-25 12:12 by userper
[考研] 085600材料与化工调剂 +9 A-哆啦Z梦 2026-03-23 15/750 2026-03-25 11:18 by Ainin_
[考研] 286求调剂 +11 Faune 2026-03-21 11/550 2026-03-25 10:11 by 雾散后相遇lc
[考研] 食品专硕 一志愿双一流 328 +3 xiaom99 2026-03-21 4/200 2026-03-24 21:20 by lailaisimei
[考研] 300求调剂，材料科学英一数二 +5 leaflight 2026-03-24 5/250 2026-03-24 16:25 by laoshidan
[考研] 一志愿哈工大，085400，320，求调剂 +3 gdlf9999 2026-03-24 3/150 2026-03-24 10:08 by 搏击518
[考研] 一志愿重庆大学085700资源与环境，总分308求调剂 +7 墨墨漠 2026-03-23 8/400 2026-03-23 20:36 by Creta
[考研] 336求调剂 +4 收到VS 2026-03-20 4/200 2026-03-23 19:02 by macy2011
[考研] 280分求调剂 一志愿085802 +4 PUMPT 2026-03-22 7/350 2026-03-22 22:13 by 星空星月
[考研] 一志愿东华大学控制学硕320求调剂 +3 Grand777 2026-03-21 3/150 2026-03-21 19:23 by 简之-
[考研] 297求调剂 +3 喜欢还是不甘心 2026-03-20 3/150 2026-03-21 18:33 by 学员8dgXkO
[考研] 求助 +5 梦里的无言 2026-03-21 6/300 2026-03-21 17:51 by 学员8dgXkO
[考研] 266求调剂 +3 哇呼哼呼哼 2026-03-20 3/150 2026-03-21 16:46 by barlinike
[考研] 265求调剂 +12 梁梁校校 2026-03-19 14/700 2026-03-21 13:38 by lature00
[考研] 中南大学化学学硕337求调剂 +3 niko- 2026-03-19 6/300 2026-03-20 21:58 by luoyongfeng
[考研] A区线材料学调剂 +5 周周无极 2026-03-20 5/250 2026-03-20 21:33 by laoshidan
[考研] 材料学硕297已过四六级求调剂推荐 +11 adaie 2026-03-19 11/550 2026-03-20 21:30 by laoshidan
[考研] 261求B区调剂，科研经历丰富 +3 牛奶很忙 2026-03-20 4/200 2026-03-20 19:34 by JourneyLucky
[考研] 招收调剂硕士 +4 lidianxing 2026-03-19 12/600 2026-03-20 12:25 by lidianxing
[考研] 材料考研调剂 +3 xwt。 2026-03-19 3/150 2026-03-19 11:22 by w沐阳w
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭