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starfishfly

铜虫 (初入文坛)

[求助] 酶连之后如何检测？

电泳检测的话，图谱应该是什么样子的？
因为酶连之后做转化一直长不出来，所以在电转之前把酶连产物跑了电泳，电泳图谱类似于酶切之后的图谱。不是应该是连在载体上了吗？这个时候的质粒载体是什么状态呢？超螺旋，还是松弛闭环？
我电转时也电了 质粒载体，当时切完载体并没有割胶回收，而是直接用来酶连了，这样也不会一点都不长吧？我电的质粒载体也没有长。。。。
求解答啊！！~~！！
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1楼 2011-04-18 17:10:56
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roomofxw

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
dhd997(金币+3): good 2011-04-18 18:44:45
您回顾一下，连接和转化环节。或者是感受态的问题，或者您的抗性平板有问题。

可以再做一个，不酶切的质粒，直接转，若是都转不出来，那基本就是转化问题了。
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2楼2011-04-18 17:17:09
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starfishfly

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by roomofxw at 2011-04-18 17:17:09:
您回顾一下，连接和转化环节。或者是感受态的问题，或者您的抗性平板有问题。

可以再做一个，不酶切的质粒，直接转，若是都转不出来，那基本就是转化问题了。

电泳检测的话酶连产物的图谱是什么样子的呢？
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3楼2011-04-18 17:25:17
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郝钊

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
dhd997(金币+5): good 2011-04-18 18:45:00
starfishfly(金币+1): 酶切产物没有做割胶回收，但是有重沉，这样的话也是不受离子的影响的吧。第一次转化是转化出来的，这次不知道怎么就是长不了了。条件是一样的，只是用的限制性内切酶不同。 2011-04-21 10:19:07
如果你的连接效率还可以的话，连接液跑电泳，应该是三条带，一个载体，一个目的片段，还有一个连接产物，前两个是线性的，后面那个应该是环状的，至于是不是超螺旋就不知道了。你说酶切产物没有回收直接连接，你用的是fermentas的通用buffer？如果不是的话，一定要回收。还有，你电转质粒都没有出转化子，就是转化条件没有摸好。先用质粒摸索个最佳条件，因为连接效率再高也不如质粒的浓度高，对吧？
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4楼2011-04-18 17:38:01
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roomofxw

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

starfishfly(金币+4): 谢谢你~~~我连了之后没有长 可能是电转的时候某步有问题吧~~~ 2011-04-21 10:14:17
引用回帖:
Originally posted by starfishfly at 2011-04-18 17:25:17:
电泳检测的话酶连产物的图谱是什么样子的呢？

没做过，也见过直接跑电泳检测连接产物的……

原因很简单，转化灵敏度比跑电泳高

理论上，只要连上几个，平板上就会长，而电泳可不是随便几个就能看见的。

电泳能看见怎么也得1ng吧，算5000bp质粒，也要0.0006pmol
1mol=6.02*10^24
再算转化率 千分之一
差不多也得十万个菌落，实际上没有那么多

随感一写，漏斗百出，姑且一听，欢迎指正
真有方法，万望指教
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5楼2011-04-18 17:53:19
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空谷幽风

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
dhd997(金币+5): good 2011-04-18 18:45:23
先按二楼说的做一下。关于你问的问题，解答如下：
1.按说连接完后跑胶应该是质粒条带，但实际情况却并不是这样：首先你要知道连接效率并没有你想的那么高，并非大部分片段都可以连到载体上去，再加上片段和载体的浓度本身就非常低，因此通过跑胶很难分辨出是否发生连接的
2.假设可以通过胶分辨出条带，那么连接好的质粒有两种形态即超螺旋和开环，线性的条带为片段和酶切过的质粒
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a?,c??ae~?a,EURc§?c?μé-,cs,,a‘?é?“i1/4?i1/4?i1/4?i1/4?
6楼2011-04-18 18:07:05
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天使托

专家顾问 (职业作家)

T.Shen

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
dhd997(金币+5): good 2011-04-18 18:45:33
连接完之后你直接去点样？这样也会有条带吗？这个我还真没有试过，不过你转化之后，如果连接上的话，就会在菌体内高拷贝的复制，这样提取出来的质粒量比较大，有利于电泳检测。

一般为了验证重组质粒的话，可以利用菌液进行PCR验证，如果有目的条带然后再进行重组质粒的提取，然后再酶切验证，电泳验证；

ps:电泳验证的时候可以点上你当时酶切的质粒和酶切的基因作为对照。
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Whenever,Wherever,Anyway!MustRemember:Fight!KeepFighting!NeverGiveUp!
7楼2011-04-18 18:12:19
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安琪儿水晶

金虫 (正式写手)
我想问一下，每次转化子都会在平板上长，但是后面提质粒做酶切就切大了不对了，目的基因反而切大了，质粒是对的是怎么回事啊？
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相信自己，总会好的！
8楼2013-03-14 14:05:59
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