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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 【求助/交流】酶连转化
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tangchaoxi

新虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】酶连转化

我将载体和片段分别用同样的两个酶双酶切后酶连，转化子提质粒酶切验证，结果只有一个条带，大概载体那么大，怀疑是不是载体自连了？如果是的话，我如何避免载体自连，把我的目的片段连上去呢？请各位帮帮忙…
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1楼 2011-03-24 11:13:38
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whyann

银虫 (初入文坛)
tangchaoxi(金币+2): 2011-03-24 15:30:25
既然是双酶切，产生的应该是不同的粘性末端，怎么会自连，应该是其他问题，楼主好好回忆每步
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4楼2011-03-24 13:13:53
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gongeleven

铁杆木虫 (正式写手)
tangchaoxi(金币+1): 2011-03-24 15:32:38
载体酶切后加CIP处理
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2楼2011-03-24 11:59:39
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wqj1988926

金虫 (正式写手)
对连接产物筛选，一般不是都有一些抗性基因连接后表达之类的，
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3楼2011-03-24 12:55:58
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yabxxh

木虫 (正式写手)
tangchaoxi(金币+3): 2011-03-24 15:26:27
这个的话建议酶切时间在四个小时以上，以保证酶切的彻底，另外你的目的片段浓度要足够的高，最关键的就是载体和目的片段的比例了，我一般是用肉眼观察，然后决定二者的用量，当然还有极端派会去测od，然后算出精确地比例，载体和插入片段的mol比最好是2:7，还有就是连接时间了，快速的话要半个小时，一般的要过夜，做到以上几点，应该会没有自连了，其实自连还是酶切不够彻底，因为你是粘性末端，应该很好做的，好运
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5楼2011-03-24 14:03:39
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