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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 【求助】T载体转化DH5α，平板上没有斑
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xnbioinfor

铜虫 (小有名气)

[交流] 【求助】T载体转化DH5α，平板上没有斑

平板上只有零星的2、3 个 白斑，到底是为什么呢？转化时需要注意什么呢？涂板有什么注意事项吗
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1楼2011-04-08 12:34:23
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睡着数绵羊

银虫 (小有名气)
★
xnbioinfor(金币+1):谢谢参与
说明转化效率不高哦，先挑白斑看看是不是，你的转化体系是多少，涂了多少的菌液。T载体很好连的。
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2楼2011-04-08 13:23:51
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天使托

专家顾问 (职业作家)
★ ★
xnbioinfor(金币+1):谢谢参与
amisking(金币+1): 鼓励发帖交流。 2011-04-08 19:58:14
看天(EPI+1): 2011-04-09 01:50:01
1: DH5α的感受态细胞效率不高。。。可以重新做感受态细胞或者购买
2：转化后你在摇床上摇的时间可以稍微长一些；
3：涂布的时候可以多涂布一些

其实楼主说的可以详细一些，这样方便大家给你解答！
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3楼2011-04-08 14:58:54
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xnbioinfor

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 天使托 at 2011-04-08 14:58:54:
1: DH5α的感受态细胞效率不高。。。可以重新做感受态细胞或者购买
2：转化后你在摇床上摇的时间可以稍微长一些；
3：涂布的时候可以多涂布一些

其实楼主说的可以详细一些，这样方便大家给你解答！

我是上午涂的板子，因为时间不好，就放在4度冰箱，晚上7点半放到37度恒温培养箱里，早上9点看着就没几个斑？是不是放在4度导致的呢？还有就是我涂板用力可能大了些
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4楼2011-04-08 16:56:06
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yabxxh

木虫 (正式写手)
★
xnbioinfor(金币+1):谢谢参与
这个和感受态，你片段的浓度以及感受态都有关系，另外蓝白斑筛选没必要用，假阳性很高，热激前后不要动摇管，复苏转速可以小一点，170rpm左右，好运
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5楼2011-04-08 16:59:19
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jhu132llh

荣誉版主 (知名作家)
★ ★
xnbioinfor(金币+1):谢谢参与
amisking(金币+1): 鼓励发帖交流。 2011-04-08 19:58:23
看天(EPI+1): 2011-04-09 01:50:20
T载体的连接效率还是很高的
按说不应该出现这个现象
分析一下原因：
1.确保连接没问题
2.DH5a的转化效率没问题，感受态放-80久了效率会降低的
3.这个和先在4度放里一阵可能是会有关系，毕竟转化后是没有经生长激活后在放于4度的。我们的都是转化后先让它长，要是赶上时间不合适就先把在37度培养上6小时以上在放在4度的
4.涂板的时候只要没把菌烫死的话，手法值影响单菌落的重叠，而不会影响菌落的生长的
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7楼2011-04-08 17:23:46
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mazhenggen

铁虫 (正式写手)
★
xnbioinfor(金币+1):谢谢参与
42摄氏度热激的时候不要动，一般70秒到九十秒比较好。热激后要立即放在冰上5分钟
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8楼2011-04-08 19:52:01
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blackrose8089

铁杆木虫 (职业作家)
★
xnbioinfor(金币+1):谢谢参与
极有可能是4度放的时间长了些！
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9楼2011-04-08 20:09:55
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xnbioinfor

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 天使托 at 2011-04-08 14:58:54:
1: DH5α的感受态细胞效率不高。。。可以重新做感受态细胞或者购买
2：转化后你在摇床上摇的时间可以稍微长一些；
3：涂布的时候可以多涂布一些

其实楼主说的可以详细一些，这样方便大家给你解答！

我是将20ul 的DH5 与5ul的T-easy 连接体系 混合 转化的
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10楼2011-04-08 22:29:24
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雪湛蓝

金虫 (正式写手)
★
xnbioinfor(金币+1):谢谢参与
引用回帖:
Originally posted by mazhenggen at 2011-04-08 19:52:01:
42摄氏度热激的时候不要动，一般70秒到九十秒比较好。热激后要立即放在冰上5分钟

热激时间：70-90s是不是太长了啊？这样菌不就死了吗（如果不是耐热菌的话）？
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11楼2011-04-08 22:40:06
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314243568

银虫 (小有名气)
★
xnbioinfor(金币+1):谢谢参与
我也在做这个。。。。感觉是样品DNA的问题。。。有两个也没有长出来。。。不知道DNA样品高GC含量，形成2级结构对酶连有没有影响。。。。
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16楼2011-04-14 14:59:09
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janyan

银虫 (初入文坛)
★
xnbioinfor(金币+1):谢谢参与
看帖时我惊出一身冷汗，我说这跟我昨天做的是一样的事情啊，4°c，，，，
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17楼2011-04-14 17:42:42
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janyan

银虫 (初入文坛)
你把斑先挑了，斑那么少说不定正确率还不低
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18楼2011-04-14 17:43:32
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xnbioinfor

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by janyan at 2011-04-14 17:43:32:
你把斑先挑了，斑那么少说不定正确率还不低

你的斑长得怎么样？
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19楼2011-04-14 22:51:06
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janyan

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by xnbioinfor at 2011-04-14 22:51:06:
你的斑长得怎么样？

三个板，只有两个出了斑，其中一个板上只有1个斑，另一个4个斑，不过斑特异性都蛮高，都是我想要的
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20楼2011-04-15 13:18:50
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wwm2008505

金虫 (小有名气)
★
xnbioinfor(金币+1): 谢谢参与
引用回帖:
16楼: Originally posted by 314243568 at 2011-04-14 14:59:09
我也在做这个。。。。感觉是样品DNA的问题。。。有两个也没有长出来。。。不知道DNA样品高GC含量，形成2级结构对酶连有没有影响。。。。

请教一下，我的序列GC含量67%，pcr样品是切胶回收的。转化之后只长了四五个。不知道GC含量对转化影响大么。谢谢。
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21楼2013-10-28 17:34:24
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yanhualover6楼
2011-04-08 17:04   回复  
xnbioinfor(金币+1):谢谢参与
angelkiss12楼
2011-04-09 00:39   回复  
xnbioinfor(金币+1):谢谢参与
tsingsoon13楼
2011-04-09 08:45   回复  
xnbioinfor(金币+1):谢谢参与
200915514楼
2011-04-09 09:42   回复  
xnbioinfor(金币+1):谢谢参与
cd816615楼
2011-04-09 09:54   回复  
xnbioinfor(金币+1):谢谢参与
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