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郝连芷水

木虫 (小有名气)

[求助] 酶切酶连转化

各位,请教个问题。
我需要重组构建个质粒,要将A质粒的7kb片段PCR出来(KOD酶),B质粒的1.7kb片段PCR出来(Pfu酶),然后再进行双酶切,酶连,转化(没有好的酶切位点,只有P出来)。
现在遇到的问题是P出来的非特异带很多,目的带回收后浓度非常低15ng/µl(100µl体系),而且目的条带有时有有时没有。然后我还要酶切,再回收,几乎就没有了,然后转感受态,做了n批,都没有阳性克隆,不知道问题出在哪里。求教如何改善?
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笑笑2697

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
wanhscn(金币+3): 鼓励新虫友回帖应助,再接再励! 2011-12-27 20:20:14
无阳性克隆就是未连接成功,主要原因就是说目的基因少。可以重新考虑设计引物,或第一次PCR产物纯化后以此纯化产物为模板继续PCR。
10楼2011-12-27 14:46:24
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分子实验哥

捐助贵宾 (小有名气)


【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
西瓜(金币+1): 鼓励应助 2011-12-26 11:39:36
片段太短   最好用巢式PCR   这样特异性应该会高点
2楼2011-12-25 22:15:29
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imyting

至尊木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
西瓜(金币+1): 鼓励交流 2011-12-26 11:40:18
切胶回收来的可以再进行PCR,扩大量,切胶回收来的那一部分可以直接作为模板保存
悠哉游哉做实验,成兮败兮我随便
3楼2011-12-26 09:36:19
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郝连芷水

木虫 (小有名气)

引用回帖:
: Originally posted by imyting at 2011-12-26 09:36:19:
切胶回收来的可以再进行PCR,扩大量,切胶回收来的那一部分可以直接作为模板保存

大哥,我也这么做过了,可是我发现效果还是差不多,有时候还没直接拿质粒p的效果好。
4楼2011-12-26 11:15:13
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