应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

Znn3bq.jpeg
小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 请教一个PCR产物直接酶切的问题
291/1返回列表
查看: 2710  |  回复: 28
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

barrey

铁虫 (正式写手)

[交流] 请教一个PCR产物直接酶切的问题

本人最近做PCR产物直接酶切来验证某个基因SNP的差异，野生型中含有可以酶切的一个位点，突变型中不含有酶切位点，PCR反应用全式金的Eco Taq Mix扩增的，片段大小为859bp，见附图中的1,2，3，9,10泳道，限制性内切酶用的不常用的Hpy99I(NEB),PCR产物没有过柱回收，连续做了好几次，用野生型的PCR产物酶切后均没有任何条带，今天酶切条件是25uL体系，2U酶，加了BSA,以第10泳道的PCR产物5uL作为模板酶切（昨天分别做了10uL和15uL的模板浓度，均无酶切条带，所以推测不是模板浓度的问题），酶切结果在第十一泳道，什么条带都没有。
另外，由于该PCR产物中有单一的HindIII酶切位点，因此选择HindIII作为阳性对照，做了平行的酶切反应，酶切结果见泳道4-8.
请问导致这种现象的原因是什么，谢谢。



PCR产物酶切.jpg

[ Last edited by barrey on 2012-9-3 at 07:38 ]
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:

» 抢金币啦！回帖就可以得到:

查看全部散金贴
1楼 2012-08-28 17:28:35
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
回帖置顶 ( 共有8个 )

137167741

至尊木虫 (著名写手)
★ ★ ★ ★
barrey(金币+1): 谢谢参与
wizardfan: 金币+3, 很详细的回答 2012-08-29 05:24:01
第一、marker 多大？
第二、上样量多大？
第三、酶切之后的两条带都是多大？
第四、这个的不常用的Hpy99II (NEB）酶切效率怎样？与常见的HindIII相比。
第五、可以尝试一下柱回收。
~~~~
赞一下(1人) 回复此楼
2楼2012-08-28 20:42:21
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

zhoubaibin

金虫 (正式写手)
★
barrey(金币+1): 谢谢参与
最好阅读相关文献
赞一下 回复此楼
10楼2012-08-29 06:23:20
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

irenescbg

金虫 (小有名气)
★ ★ ★
barrey(金币+1): 谢谢参与
yqbter: 金币+2, 鼓励发帖！ 2012-09-03 13:20:29
1. 你用的是Hpy99II 还是Hpy99I ？
2. 酶切突变型的PCR产物也是同样会把产物降解了吗？
3. 酶切带有这个位点的质粒，效果如何？是否可以保证这个酶没被污染？
4. 尝试回收纯化PCR产物切一次，如果效果相同，那可能真的是酶的问题。
赞一下 回复此楼
16楼2012-08-29 08:52:28
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

阿牧

金虫 (小有名气)
★ ★ ★
barrey(金币+1): 谢谢参与
yqbter: 金币+2, 不错的回答！ 2012-08-29 17:45:16
第一个问题：第11泳道完全没有条带，即使没有切开也不应看不到条带，是否酶切底物太少？（该问题很重要）
以下仅供参考：
1、Eco Taq Mix是否高保真，你的PCR过程高保真很重要
2、Hpy99II 不常用，最好认真研究下该酶的特性(限制性位点、最适温度等)
3、最好纯化下PCR产物，否则会影响酶的效率
赞一下(1人) 回复此楼
17楼2012-08-29 08:59:18
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

zoelxx

铁杆木虫 (正式写手)
★
barrey(金币+1): 谢谢参与
如果是活力不高的酶，pcr产物应该纯化捏
赞一下 回复此楼
20楼2012-08-30 08:35:02
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

constra

金虫 (小有名气)
★ ★ ★
barrey(金币+1): 谢谢参与
看天: 金币+2, 鼓励交流 2012-09-01 06:56:56
NEB网站上找不到Hpy99II阿，只有Hpy99I，是不是酶搞错了。当然这个不能解决楼主的问题，看楼主的胶，直接想到的可能就是DNase污染，当然还有个不太可能的原因，看楼主的胶，边缘发黑，是不是照相的时候边缘没有在紫光灯的范围里？肉眼观察也什么都看不到么？
赞一下 回复此楼
21楼2012-08-31 21:45:31
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

yaoshu210

禁虫 (著名写手)
★
barrey(金币+1): 谢谢参与
本帖内容被屏蔽
22楼2012-08-31 21:57:32
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

barrey

铁虫 (正式写手)
引用回帖:
17楼: Originally posted by 阿牧 at 2012-08-29 08:59:18
第一个问题：第11泳道完全没有条带，即使没有切开也不应看不到条带，是否酶切底物太少？（该问题很重要）
以下仅供参考：
1、Eco Taq Mix是否高保真，你的PCR过程高保真很重要
2、Hpy99II 不常用，最好认真研究下 ...

重复做了一下实验，发现是酶切底物浓度太低，但是正常酶切后的条带浓度仍很低。
赞一下 回复此楼
26楼2012-09-03 07:37:49
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

凤凰-涅磐

金虫 (著名写手)
★
barrey(金币+1): 谢谢参与
过来逛逛，顶一下！
回复此楼
12楼2012-08-29 07:36:06
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
简单回复
yingying15883楼
2012-08-28 21:34   回复  
barrey(金币+1): 谢谢参与
ailingzhihun4楼
2012-08-28 21:41   回复  
barrey(金币+1): 谢谢参与
xachenxi5楼
2012-08-28 21:46   回复  
barrey(金币+1): 谢谢参与
liufuliang6楼
2012-08-28 22:00   回复  
barrey(金币+1): 谢谢参与
138361284967楼
2012-08-28 22:29   回复  
barrey(金币+1): 谢谢参与
goingabroad8楼
2012-08-28 22:48   回复  
barrey(金币+1): 谢谢参与
wizardfan9楼
2012-08-29 05:23   回复  
barrey(金币+1): 谢谢参与
userhung11楼
2012-08-29 07:09   回复  
barrey(金币+1): 谢谢参与
应用人生13楼
2012-08-29 07:38   回复  
barrey(金币+1): 谢谢参与
zhoucb14楼
2012-08-29 07:49   回复  
barrey(金币+1): 谢谢参与
yanzongwei15楼
2012-08-29 08:17   回复  
barrey(金币+1): 谢谢参与
Ayse18楼
2012-08-29 11:29   回复  
barrey(金币+1): 谢谢参与
氢化大雪19楼
2012-08-29 22:02   回复  
barrey(金币+1): 谢谢参与
hengab23楼
2012-08-31 22:05   回复  
barrey(金币+1): 谢谢参与
秋之落叶24楼
2012-08-31 23:02   回复  
barrey(金币+1): 谢谢参与
木米月厷25楼
2012-08-31 23:23   回复  
barrey(金币+1): 谢谢参与
20091262227楼
2012-09-03 08:23   回复  
barrey(金币+1): 谢谢参与
祝福
lifuqiang928楼
2012-09-03 09:13   回复  
barrey(金币+1): 谢谢参与
zfj2011060329楼
2013-05-30 14:52   回复  
barrey(金币+1): 谢谢参与
相关版块跳转 我要订阅楼主 barrey 的主题更新
291/1返回列表
普通表情 龙 兔 虎 猫 高级回复 (可上传附件)
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭