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barrey

铁虫 (正式写手)

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[交流] 请教一个PCR产物直接酶切的问题

本人最近做PCR产物直接酶切来验证某个基因SNP的差异，野生型中含有可以酶切的一个位点，突变型中不含有酶切位点，PCR反应用全式金的Eco Taq Mix扩增的，片段大小为859bp，见附图中的1,2，3，9,10泳道，限制性内切酶用的不常用的Hpy99I(NEB),PCR产物没有过柱回收，连续做了好几次，用野生型的PCR产物酶切后均没有任何条带，今天酶切条件是25uL体系，2U酶，加了BSA,以第10泳道的PCR产物5uL作为模板酶切（昨天分别做了10uL和15uL的模板浓度，均无酶切条带，所以推测不是模板浓度的问题），酶切结果在第十一泳道，什么条带都没有。
另外，由于该PCR产物中有单一的HindIII酶切位点，因此选择HindIII作为阳性对照，做了平行的酶切反应，酶切结果见泳道4-8.
请问导致这种现象的原因是什么，谢谢。

PCR产物酶切.jpg

[ Last edited by barrey on 2012-9-3 at 07:38 ]

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1楼 2012-08-28 17:28:35

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阿牧

金虫 (小有名气)

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★ ★ ★
barrey(金币+1): 谢谢参与
yqbter: 金币+2, 不错的回答！ 2012-08-29 17:45:16

第一个问题：第11泳道完全没有条带，即使没有切开也不应看不到条带，是否酶切底物太少？（该问题很重要）
以下仅供参考：
1、Eco Taq Mix是否高保真，你的PCR过程高保真很重要
2、Hpy99II 不常用，最好认真研究下该酶的特性(限制性位点、最适温度等)
3、最好纯化下PCR产物，否则会影响酶的效率