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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 请教一个PCR产物直接酶切的问题
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barrey

铁虫 (正式写手)

[交流] 请教一个PCR产物直接酶切的问题

本人最近做PCR产物直接酶切来验证某个基因SNP的差异，野生型中含有可以酶切的一个位点，突变型中不含有酶切位点，PCR反应用全式金的Eco Taq Mix扩增的，片段大小为859bp，见附图中的1,2，3，9,10泳道，限制性内切酶用的不常用的Hpy99I(NEB),PCR产物没有过柱回收，连续做了好几次，用野生型的PCR产物酶切后均没有任何条带，今天酶切条件是25uL体系，2U酶，加了BSA,以第10泳道的PCR产物5uL作为模板酶切（昨天分别做了10uL和15uL的模板浓度，均无酶切条带，所以推测不是模板浓度的问题），酶切结果在第十一泳道，什么条带都没有。
另外，由于该PCR产物中有单一的HindIII酶切位点，因此选择HindIII作为阳性对照，做了平行的酶切反应，酶切结果见泳道4-8.
请问导致这种现象的原因是什么，谢谢。



PCR产物酶切.jpg

[ Last edited by barrey on 2012-9-3 at 07:38 ]
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1楼 2012-08-28 17:28:35
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137167741

至尊木虫 (著名写手)
★ ★ ★ ★
barrey(金币+1): 谢谢参与
wizardfan: 金币+3, 很详细的回答 2012-08-29 05:24:01
第一、marker 多大？
第二、上样量多大？
第三、酶切之后的两条带都是多大？
第四、这个的不常用的Hpy99II (NEB）酶切效率怎样？与常见的HindIII相比。
第五、可以尝试一下柱回收。
~~~~
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2楼2012-08-28 20:42:21
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阿牧

金虫 (小有名气)
★ ★ ★
barrey(金币+1): 谢谢参与
yqbter: 金币+2, 不错的回答！ 2012-08-29 17:45:16
第一个问题：第11泳道完全没有条带，即使没有切开也不应看不到条带，是否酶切底物太少？（该问题很重要）
以下仅供参考：
1、Eco Taq Mix是否高保真，你的PCR过程高保真很重要
2、Hpy99II 不常用，最好认真研究下该酶的特性(限制性位点、最适温度等)
3、最好纯化下PCR产物，否则会影响酶的效率
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17楼2012-08-29 08:59:18
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zhoubaibin

金虫 (正式写手)
★
barrey(金币+1): 谢谢参与
最好阅读相关文献
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10楼2012-08-29 06:23:20
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凤凰-涅磐

金虫 (著名写手)
★
barrey(金币+1): 谢谢参与
过来逛逛，顶一下！
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12楼2012-08-29 07:36:06
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irenescbg

金虫 (小有名气)
★ ★ ★
barrey(金币+1): 谢谢参与
yqbter: 金币+2, 鼓励发帖！ 2012-09-03 13:20:29
1. 你用的是Hpy99II 还是Hpy99I ？
2. 酶切突变型的PCR产物也是同样会把产物降解了吗？
3. 酶切带有这个位点的质粒，效果如何？是否可以保证这个酶没被污染？
4. 尝试回收纯化PCR产物切一次，如果效果相同，那可能真的是酶的问题。
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16楼2012-08-29 08:52:28
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zoelxx

铁杆木虫 (正式写手)
★
barrey(金币+1): 谢谢参与
如果是活力不高的酶，pcr产物应该纯化捏
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20楼2012-08-30 08:35:02
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constra

金虫 (小有名气)
★ ★ ★
barrey(金币+1): 谢谢参与
看天: 金币+2, 鼓励交流 2012-09-01 06:56:56
NEB网站上找不到Hpy99II阿，只有Hpy99I，是不是酶搞错了。当然这个不能解决楼主的问题，看楼主的胶，直接想到的可能就是DNase污染，当然还有个不太可能的原因，看楼主的胶，边缘发黑，是不是照相的时候边缘没有在紫光灯的范围里？肉眼观察也什么都看不到么？
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21楼2012-08-31 21:45:31
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yaoshu210

禁虫 (著名写手)
★
barrey(金币+1): 谢谢参与
本帖内容被屏蔽
22楼2012-08-31 21:57:32
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barrey

铁虫 (正式写手)
引用回帖:
17楼: Originally posted by 阿牧 at 2012-08-29 08:59:18
第一个问题：第11泳道完全没有条带，即使没有切开也不应看不到条带，是否酶切底物太少？（该问题很重要）
以下仅供参考：
1、Eco Taq Mix是否高保真，你的PCR过程高保真很重要
2、Hpy99II 不常用，最好认真研究下 ...

重复做了一下实验，发现是酶切底物浓度太低，但是正常酶切后的条带浓度仍很低。
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26楼2012-09-03 07:37:49
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yingying15883楼
2012-08-28 21:34   回复  
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ailingzhihun4楼
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