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苏拉的世界

金虫 (著名写手)


[交流] PCR鉴定与酶切鉴定

构建了一个表达载体,特别特别的闹心,以为弄好了呢,PCR鉴定的时候都会有目的条带,但是酶切的时候就没有了,呢呢呢。气死我了,是当它存在还是不存在,我要疯掉了
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qjy_134

铜虫 (小有名气)



苏拉的世界(金币+1):谢谢参与
苏拉的世界(金币+1): 嗯,那你说是哪个的问题 2011-06-21 10:55:10
你鉴定的时候用载体上的引物
抽的质粒纯度要高
2楼2011-06-21 10:34:16
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lihuaannie

新虫 (初入文坛)



苏拉的世界(金币+1):谢谢参与
鉴定采用载体上面的引物,注意是否同尾酶连接,
3楼2011-06-21 13:26:03
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阿修罗Axuro

金虫 (小有名气)



苏拉的世界(金币+1):谢谢参与
PCR只能初选,必须以酶切为准,酶切对了,然后送去测序。最后的测序结果才是可靠的。
4楼2011-06-21 14:28:41
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苏拉的世界

金虫 (著名写手)


引用回帖:
Originally posted by 阿修罗Axuro at 2011-06-21 14:28:41:
PCR只能初选,必须以酶切为准,酶切对了,然后送去测序。最后的测序结果才是可靠的。

为什么切不出来,哼,我要疯了
5楼2011-06-21 15:06:15
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阿修罗Axuro

金虫 (小有名气)



苏拉的世界(金币+1): 恩谢谢,哎。。。 2011-06-21 18:15:41
amisking(金币+1): 鼓励应助 2011-06-21 18:26:26
是这样的,一般PCR鉴定的假阳性很高。
我一般就是只有样本数很多的时候才用菌液做PCR,初步鉴定,然后再阳性的里面提质粒,酶切鉴定。如果样本少,就直接提质粒,酶切鉴定。据我做PCR鉴定很多次得经验来看,PCR鉴定的假阳性确实很高。不太可信
6楼2011-06-21 17:13:27
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wuzuobin125

铜虫 (小有名气)



小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖
楼主不用太烦恼嘛,
如果是你的酶切体系和操作没有问题,那你就需要重新构建载体,重新来过了,其实也没有什么啊,生物实验就是要不断的重复的。
楼上很多童鞋们都很有经验了,PCR鉴定的假阳性机率甚高,不能以此为准,既然如此,那么是否说明楼主的载体构建没有成功呢?
我实验时都不考虑构建载体后进行PCR 鉴定,一般转化后挑取单菌落培养,提取质粒后酶切鉴定。
7楼2011-06-21 21:06:14
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苏拉的世界

金虫 (著名写手)


引用回帖:
Originally posted by wuzuobin125 at 2011-06-21 21:06:14:
楼主不用太烦恼嘛,
如果是你的酶切体系和操作没有问题,那你就需要重新构建载体,重新来过了,其实也没有什么啊,生物实验就是要不断的重复的。
楼上很多童鞋们都很有经验了,PCR鉴定的假阳性机率甚高,不能以 ...

嗯,谢谢您了,只是您不知道我这个载体构建的有多困难。。。
8楼2011-06-22 09:03:01
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苏拉的世界

金虫 (著名写手)


引用回帖:
Originally posted by 阿修罗Axuro at 2011-06-21 17:13:27:
是这样的,一般PCR鉴定的假阳性很高。
我一般就是只有样本数很多的时候才用菌液做PCR,初步鉴定,然后再阳性的里面提质粒,酶切鉴定。如果样本少,就直接提质粒,酶切鉴定。据我做PCR鉴定很多次得经验来看,PCR鉴 ...

嗯。。。谢谢您了。。。
9楼2011-06-22 09:04:27
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睡着数绵羊

银虫 (小有名气)



小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖
PCR有条带,当然是确定是对的为前提,酶切有没有可能存在一下问题:
1.目的片段中是否存在你的酶切位点
2.连接体系是否正确
3.如果做的是很常规的重组质粒构建的话,直接提质粒就可以看到是否有重组质粒存在,否则可以做下菌落PCR,确定有阳性存在在提质粒做进一步的酶切鉴定,做菌落PCR时也要注意下方法,做不好假阳性出现几率很大。
最主要是确定下问题1,如果排除这点的话问题还是不大,重新连接做就可以了,如果连接效率不好,可以走下T载体,虽然麻烦些,但是是个很有用的方法。
祝实验顺利,我做的时候也是很纠结的,花了很久才弄出来,嘿嘿!
10楼2011-06-22 09:38:35
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苏拉的世界

金虫 (著名写手)


引用回帖:
Originally posted by 睡着数绵羊 at 2011-06-22 09:38:35:
PCR有条带,当然是确定是对的为前提,酶切有没有可能存在一下问题:
1.目的片段中是否存在你的酶切位点
2.连接体系是否正确
3.如果做的是很常规的重组质粒构建的话,直接提质粒就可以看到是否有重组质粒存在, ...

谢谢您啦
11楼2011-06-22 09:47:16
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biobiobio

新虫 (初入文坛)



小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
你这个载体构建是如此费劲,是因为你没有用ClonExpress
菌落PCR,酶切鉴定如果都过关了,基本可以宣告你的实验成功了。
12楼2012-11-26 20:16:59
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