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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » PCR鉴定与酶切鉴定
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苏拉的世界

金虫 (著名写手)

[交流] PCR鉴定与酶切鉴定

构建了一个表达载体，特别特别的闹心，以为弄好了呢，PCR鉴定的时候都会有目的条带，但是酶切的时候就没有了，呢呢呢。气死我了，是当它存在还是不存在，我要疯掉了
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1楼 2011-06-21 10:19:16
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qjy_134

铜虫 (小有名气)
★
苏拉的世界(金币+1):谢谢参与
苏拉的世界(金币+1): 嗯，那你说是哪个的问题 2011-06-21 10:55:10
你鉴定的时候用载体上的引物
抽的质粒纯度要高
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2楼2011-06-21 10:34:16
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lihuaannie

新虫 (初入文坛)
★
苏拉的世界(金币+1):谢谢参与
鉴定采用载体上面的引物，注意是否同尾酶连接，
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3楼2011-06-21 13:26:03
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阿修罗Axuro

金虫 (小有名气)
★
苏拉的世界(金币+1):谢谢参与
PCR只能初选，必须以酶切为准，酶切对了，然后送去测序。最后的测序结果才是可靠的。
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4楼2011-06-21 14:28:41
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苏拉的世界

金虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by 阿修罗Axuro at 2011-06-21 14:28:41:
PCR只能初选，必须以酶切为准，酶切对了，然后送去测序。最后的测序结果才是可靠的。

为什么切不出来，哼，我要疯了
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5楼2011-06-21 15:06:15
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阿修罗Axuro

金虫 (小有名气)
★
苏拉的世界(金币+1): 恩谢谢，哎。。。 2011-06-21 18:15:41
amisking(金币+1): 鼓励应助 2011-06-21 18:26:26
是这样的，一般PCR鉴定的假阳性很高。
我一般就是只有样本数很多的时候才用菌液做PCR，初步鉴定，然后再阳性的里面提质粒，酶切鉴定。如果样本少，就直接提质粒，酶切鉴定。据我做PCR鉴定很多次得经验来看，PCR鉴定的假阳性确实很高。不太可信
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6楼2011-06-21 17:13:27
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wuzuobin125

铜虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
楼主不用太烦恼嘛，
如果是你的酶切体系和操作没有问题，那你就需要重新构建载体，重新来过了，其实也没有什么啊，生物实验就是要不断的重复的。
楼上很多童鞋们都很有经验了，PCR鉴定的假阳性机率甚高，不能以此为准，既然如此，那么是否说明楼主的载体构建没有成功呢？
我实验时都不考虑构建载体后进行PCR 鉴定，一般转化后挑取单菌落培养，提取质粒后酶切鉴定。
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7楼2011-06-21 21:06:14
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苏拉的世界

金虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by wuzuobin125 at 2011-06-21 21:06:14:
楼主不用太烦恼嘛，
如果是你的酶切体系和操作没有问题，那你就需要重新构建载体，重新来过了，其实也没有什么啊，生物实验就是要不断的重复的。
楼上很多童鞋们都很有经验了，PCR鉴定的假阳性机率甚高，不能以 ...

嗯，谢谢您了，只是您不知道我这个载体构建的有多困难。。。
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8楼2011-06-22 09:03:01
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苏拉的世界

金虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by 阿修罗Axuro at 2011-06-21 17:13:27:
是这样的，一般PCR鉴定的假阳性很高。
我一般就是只有样本数很多的时候才用菌液做PCR，初步鉴定，然后再阳性的里面提质粒，酶切鉴定。如果样本少，就直接提质粒，酶切鉴定。据我做PCR鉴定很多次得经验来看，PCR鉴 ...

嗯。。。谢谢您了。。。
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9楼2011-06-22 09:04:27
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睡着数绵羊

银虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
PCR有条带，当然是确定是对的为前提，酶切有没有可能存在一下问题：
1.目的片段中是否存在你的酶切位点
2.连接体系是否正确
3.如果做的是很常规的重组质粒构建的话，直接提质粒就可以看到是否有重组质粒存在，否则可以做下菌落PCR，确定有阳性存在在提质粒做进一步的酶切鉴定，做菌落PCR时也要注意下方法，做不好假阳性出现几率很大。
最主要是确定下问题1，如果排除这点的话问题还是不大，重新连接做就可以了，如果连接效率不好，可以走下T载体，虽然麻烦些，但是是个很有用的方法。
祝实验顺利，我做的时候也是很纠结的，花了很久才弄出来，嘿嘿！
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10楼2011-06-22 09:38:35
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苏拉的世界

金虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by 睡着数绵羊 at 2011-06-22 09:38:35:
PCR有条带，当然是确定是对的为前提，酶切有没有可能存在一下问题：
1.目的片段中是否存在你的酶切位点
2.连接体系是否正确
3.如果做的是很常规的重组质粒构建的话，直接提质粒就可以看到是否有重组质粒存在， ...

谢谢您啦
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11楼2011-06-22 09:47:16
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biobiobio

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
你这个载体构建是如此费劲，是因为你没有用ClonExpress
菌落PCR，酶切鉴定如果都过关了，基本可以宣告你的实验成功了。
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12楼2012-11-26 20:16:59
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