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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 实验/技术 » 关于筛选和鉴定细菌(16S rRNA)
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西门炊饼

铁虫 (初入文坛)

[求助] 关于筛选和鉴定细菌(16S rRNA)

目前我的实验需要将样品中细菌分离出来并鉴定，希望能分离出我感兴趣的菌，如果能发现新细菌就更好了，对于如何筛选和鉴定，我有这样的难题：
    感觉用Vitek-2自动分析仪鉴定菌工作量太大，而且费时间，首先得将样品用几种增菌液增菌，然后增菌液又划到几种筛选平板上，平板上挑单菌落划线，接种3代以上纯化，然后革兰氏染色（这步工作量大），最后拿去全自动微生物分析仪上去分析，鉴定卡贵，还不一定能全给鉴定出来，忒麻烦。往往一天要划上百块平板，如果做得多，更恐怖。
    我的目的是筛菌，理想结果是筛到我感兴趣的菌，或者是新细菌。现在琢磨着用扩增16S rRNA，然后去测序的方法来筛菌，最后再拿去微生物自动分析，这样筛到新细菌的可能性大。我准备这么做，开始的步骤一样，首先得将样品用几种增菌液增菌，然后增菌液又划到几种筛选平板上，这时不挑单菌落纯化了，直接将筛选平板上的有代表性的单菌落（初步定为一块板10个左右，用以前的办法只能挑1-3个，不然工作量会吓死人）挑到盛有营养肉汤的EP管里去摇，摇好了后直接拿去菌液PCR，引物用16S rRNA的通用引物，扩增好了就送去测序。
    不知道这样的方法是否可行，敬请高人指点，恳请大家畅所欲言。我知道这个方法存在的一个问题：首先，我挑到的单菌落有可能不是单种细菌，可能是两种甚至多种细菌，这样菌液PCR扩增出来的就不是一种片段，而是几种片段，由于我不太清楚测序的过程，这种情况下测序会测出什么结果我也无法预计。强调一点：我的目的是筛菌，不是一定要把每个都准确的测出来。

[ Last edited by 西门炊饼 on 2011-8-29 at 13:54 ]
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1楼 2011-08-29 13:45:39
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

abduwaly

新虫 (初入文坛)
你好，微生物分离鉴定可分为可培养微生物鉴定和不可培养微生物鉴定。可培养法是需要必须经过细心培养和纯化。而不可培养法不需要分离，只是把总DNA提取进行PAGE电泳即可得到样品中的细菌类型。但不能获得菌落的信息。从你的描述来看你是想做可培养细菌的鉴定，那么必须经过细心培养，纯化和鉴定。如果你的目的是分离有意义的细菌那么要用两种以上的培养基，觉得工作量多可选择一种培养基（注意不要用LB和TSA培养基），最好是适合你的样品生长的培养基（需自己查资料）。另外我建议你你所说的VITEK2，COMPAT等仪器是人体微生物检验专用，含有少数工业微生物，不适合土壤微生物。所以你要考虑你的样品和你想获得什么类型的微生物。
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16楼2011-09-02 01:47:15
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yemuren

铁杆木虫 (正式写手)
首先，我同意楼主先用16s来鉴定，一般情况下16s能鉴定到属，得到想要的后再用生理生化鉴定，工作量会小很多。但是，LZ的分子鉴定方法有待商榷，菌落不纯，或者不是单克隆，那么测序结果就会出现双峰或杂峰，这样的结果是无效的，所以建议LZ还是划线纯化一下，细菌还是比较好纯化的。
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我的专长叫做流浪，所以我就做了流氓~
12楼2011-08-31 10:38:35
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普通回帖

粉靛蓝

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

测序是自己测吗，你测完了 一样要分析，既然你目的是筛菌 那你就先筛选出你想要的菌 在选几个好的鉴定吧
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2楼2011-08-29 15:50:53
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西门炊饼

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 粉靛蓝 at 2011-08-29 15:50:53:
测序是自己测吗，你测完了 一样要分析，既然你目的是筛菌 那你就先筛选出你想要的菌 在选几个好的鉴定吧

首先谢谢您，您是第一个回帖的人，这也是我第一次上论坛，呵呵。

测序当然不是自己测，送测序公司啊。我之所以想这么做，是想尽可能的不漏过我想要的菌和新菌。关键是这样的方法送测序，可行性强不强。
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3楼2011-08-29 16:40:50
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粉靛蓝

木虫 (著名写手)
那你要测很多菌了？ 那费用会很高的 测一个是一千多
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4楼2011-08-29 16:47:30
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drizzling

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

西门炊饼(金币+1): 2011-08-31 08:42:21
挑到单个菌落后不必摇菌，直接取单克隆悬起来，做PCR即可，不过原始平板上一定要标注好，否则就搞昏了。要不然就重新取一块平板，划上格子，重新接种一下，取少量菌苔，重悬进行PCR。
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5楼2011-08-29 21:25:56
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aegeansea

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

西门炊饼(金币+1): 2011-08-31 08:42:55
引用回帖:
1楼: Originally posted by 西门炊饼 at 2011-08-29 13:45:39:
目前我的实验需要将样品中细菌分离出来并鉴定，希望能分离出我感兴趣的菌，如果能发现新细菌就更好了，对于如何筛选和鉴定，我有这样的难题：
    感觉用Vitek-2自动分析仪鉴定菌工作量太大，而且费时间，首先得 ...

方法是可行的。
但前期工作量小的后果就是后期测序结果拿到后的分析工作量增大
而且还要考虑测序错误等问题
需要找一个懂生物信息的团队或人来做这个工作
否则很难达到lz的要求吧
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6楼2011-08-30 11:26:58
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quiller2000

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

如果你的课题组足够有钱，直接把你的样品拿去做deep sequencing吧

但是坦率的说，我不理解楼主的设计！
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致良知
7楼2011-08-30 23:27:17
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西门炊饼

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by aegeansea at 2011-08-30 11:26:58:
方法是可行的。
但前期工作量小的后果就是后期测序结果拿到后的分析工作量增大
而且还要考虑测序错误等问题
需要找一个懂生物信息的团队或人来做这个工作
否则很难达到lz的要求吧

我的目的就是把样品里的菌（比如说共50种菌）能够比较完整的分离出来（分离出来30种或40种）
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8楼2011-08-31 08:49:51
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西门炊饼

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
7楼: Originally posted by quiller2000 at 2011-08-30 23:27:17:
如果你的课题组足够有钱，直接把你的样品拿去做deep sequencing吧

但是坦率的说，我不理解楼主的设计！

当然只能这么整，我的目的就是把样品里的菌（比如说共50种菌）能够比较完整的分离出来（分离出来30种或40种），追求的是性价比
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9楼2011-08-31 08:53:32
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西门炊饼

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
9楼: Originally posted by 西门炊饼 at 2011-08-31 08:53:32:
当然只能这么整，我的目的就是把样品里的菌（比如说共50种菌）能够比较完整的分离出来（分离出来30种或40种），追求的是性价比

错了，“当然不能这么整”
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10楼2011-08-31 08:54:18
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