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西门炊饼

铁虫 (初入文坛)

[求助] 关于筛选和鉴定细菌(16S rRNA)

目前我的实验需要将样品中细菌分离出来并鉴定,希望能分离出我感兴趣的菌,如果能发现新细菌就更好了,对于如何筛选和鉴定,我有这样的难题:
    感觉用Vitek-2自动分析仪鉴定菌工作量太大,而且费时间,首先得将样品用几种增菌液增菌,然后增菌液又划到几种筛选平板上,平板上挑单菌落划线,接种3代以上纯化,然后革兰氏染色(这步工作量大),最后拿去全自动微生物分析仪上去分析,鉴定卡贵,还不一定能全给鉴定出来,忒麻烦。往往一天要划上百块平板,如果做得多,更恐怖。
    我的目的是筛菌,理想结果是筛到我感兴趣的菌,或者是新细菌。现在琢磨着用扩增16S rRNA,然后去测序的方法来筛菌,最后再拿去微生物自动分析,这样筛到新细菌的可能性大。我准备这么做,开始的步骤一样,首先得将样品用几种增菌液增菌,然后增菌液又划到几种筛选平板上,这时不挑单菌落纯化了,直接将筛选平板上的有代表性的单菌落(初步定为一块板10个左右,用以前的办法只能挑1-3个,不然工作量会吓死人)挑到盛有营养肉汤的EP管里去摇,摇好了后直接拿去菌液PCR,引物用16S rRNA的通用引物,扩增好了就送去测序。
    不知道这样的方法是否可行,敬请高人指点,恳请大家畅所欲言。我知道这个方法存在的一个问题:首先,我挑到的单菌落有可能不是单种细菌,可能是两种甚至多种细菌,这样菌液PCR扩增出来的就不是一种片段,而是几种片段,由于我不太清楚测序的过程,这种情况下测序会测出什么结果我也无法预计。强调一点:我的目的是筛菌,不是一定要把每个都准确的测出来。

[ Last edited by 西门炊饼 on 2011-8-29 at 13:54 ]
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西门炊饼

铁虫 (初入文坛)

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2楼: Originally posted by 粉靛蓝 at 2011-08-29 15:50:53:
测序是自己测吗,你测完了 一样要分析,既然你目的是筛菌 那你就先筛选出你想要的菌 在选几个好的鉴定吧

首先谢谢您,您是第一个回帖的人,这也是我第一次上论坛,呵呵。

测序当然不是自己测,送测序公司啊。我之所以想这么做,是想尽可能的不漏过我想要的菌和新菌。关键是这样的方法送测序,可行性强不强。
3楼2011-08-29 16:40:50
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西门炊饼

铁虫 (初入文坛)

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6楼: Originally posted by aegeansea at 2011-08-30 11:26:58:
方法是可行的。
但前期工作量小的后果就是后期测序结果拿到后的分析工作量增大
而且还要考虑测序错误等问题
需要找一个懂生物信息的团队或人来做这个工作
否则很难达到lz的要求吧

我的目的就是把样品里的菌(比如说共50种菌)能够比较完整的分离出来(分离出来30种或40种)
8楼2011-08-31 08:49:51
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西门炊饼

铁虫 (初入文坛)

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7楼: Originally posted by quiller2000 at 2011-08-30 23:27:17:
如果你的课题组足够有钱,直接把你的样品拿去做deep sequencing吧

但是坦率的说,我不理解楼主的设计!

当然只能这么整,我的目的就是把样品里的菌(比如说共50种菌)能够比较完整的分离出来(分离出来30种或40种),追求的是性价比
9楼2011-08-31 08:53:32
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9楼: Originally posted by 西门炊饼 at 2011-08-31 08:53:32:
当然只能这么整,我的目的就是把样品里的菌(比如说共50种菌)能够比较完整的分离出来(分离出来30种或40种),追求的是性价比

错了,“当然不能这么整”
10楼2011-08-31 08:54:18
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铁虫 (初入文坛)

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12楼: Originally posted by yemuren at 2011-08-31 10:38:35:
首先,我同意楼主先用16s来鉴定,一般情况下16s能鉴定到属,得到想要的后再用生理生化鉴定,工作量会小很多。但是,LZ的分子鉴定方法有待商榷,菌落不纯,或者不是单克隆,那么测序结果就会出现双峰或杂峰,这样的 ...

我是这么想的
如果先做生化鉴定:
比如说,用样品我划了一块板,假设这块板上有50个单克隆菌落,有20种菌,如果我一种菌都不想漏过,需要每个单克隆菌落都划板,需要划50块板,到最后需要做50个生化鉴定。如果我有10个样(当然远不止这么多),就得划2000+(50*10再纯化三代)块板,500次生化鉴定。这样的工作量和花费肯定不允许,那么我只能一个样挑15个左右单克隆划板,这样,很可能我错过了新细菌和我感兴趣的菌。

如果先扩增16S rRNA:同样地情况下,50个菌落我全部挑到EP管里摇菌,最后测序,保留菌液,分析测序结果后,筛选需要的菌,保留的菌液再去划线做生化鉴定。虽然没经过纯化三代,也许里面有相当一部分不纯,但也比挑10个划线得到的菌多,更完整。
13楼2011-09-01 11:25:26
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11楼: Originally posted by aegeansea at 2011-08-31 10:34:36:
测序只能鉴定 不能分离
要分离的话 还是要克隆的 这个工作没法省

我是这么想的
如果先做生化鉴定:
比如说,用样品我划了一块板,假设这块板上有50个单克隆菌落,有20种菌,如果我一种菌都不想漏过,需要每个单克隆菌落都划板,需要划50块板,到最后需要做50个生化鉴定。如果我有10个样(当然远不止这么多),就得划2000+(50*10再纯化三代)块板,500次生化鉴定。这样的工作量和花费肯定不允许,那么我只能一个样挑15个左右单克隆划板,这样,很可能我错过了新细菌和我感兴趣的菌。

如果先扩增16S rRNA:同样地情况下,50个菌落我全部挑到EP管里摇菌,最后测序,保留菌液,分析测序结果后,筛选需要的菌,保留的菌液再去划线做生化鉴定。虽然没经过纯化三代,也许里面有相当一部分不纯,但也比挑10个划线得到的菌多,更完整。
14楼2011-09-01 11:26:20
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铁虫 (初入文坛)

引用回帖:
16楼: Originally posted by abduwaly at 2011-09-02 01:47:15:
你好,微生物分离鉴定可分为可培养微生物鉴定和不可培养微生物鉴定。可培养法是需要必须经过细心培养和纯化。而不可培养法不需要分离,只是把总DNA提取进行PAGE电泳即可得到样品中的细菌类型。但不能获得菌落的信 ...

谢谢,谢谢,其实我不是微生物专业的,我是昆虫专业的,不幸给硬拉过来做微生物。我的样品是苍蝇携带菌。
17楼2011-09-02 11:47:32
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铁虫 (初入文坛)

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20楼: Originally posted by nancyyazi at 2011-09-08 09:04:04:
我觉得你既然是分离细菌(我不清楚你要分离的是什么细菌),至少要经过初筛和复筛吧。筛选出来比较好的也就那么几株,你再进行生理生化鉴定和16s RNA,这样工作量就会小很多。

什么叫初筛和复筛,比较好的标准是什么?能说详细点吗?
21楼2011-09-09 08:46:48
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