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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 实验/技术 » 微生物多样性研究的几个问题
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范慧

新虫 (初入文坛)

[求助] 微生物多样性研究的几个问题

1.所有的引物p出来的序列都可以建系统发育树吗
2.什么引物p出来的序列可用于建立基因文库啊    建立基因文库怎样分析哪种是优势菌群
3.连接转化选择阳性克隆进行扩增的步骤是什么
谢谢
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1楼 2011-10-25 17:26:38
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pcl-bunny

木虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
zhang8826857(金币+5, MicEPI+1): 不错，鼓励新虫，加油哦^_^ 2011-11-09 09:05:28
楼主，您好。关于您的问题我有一些见解，建库有很多种,可以建细菌全基因组文库，也可以建某功能基因文库，还可以建16S文库等......您应该是想建16S文库做微生物分子生态吧！如果是统计多样性，研究群落结构，进化地位和优势种群，建议答案如下：
1），16s适合做系统发育树，研究其进化地位，扩16S全长建议引物27F,1492R.(退火52度，延伸1分30秒)。
2），下面两个问题其实是一个答案：扩出16S后，酶连至PMD19-T载体，转化（导入感受态大肠杆菌种），再用蓝白斑筛选（涂菌至含X-GEL和AMP的平板），挑取白斑（阳性）同时转板，用M13扩增做菌落PCR,酶切分型跑PAGE胶，分型后，挑取代表克隆子测序构建进化树。
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NOPAIN,NOGAIN!
4楼2011-11-09 00:58:27
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zhaoyu2881

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
zhang8826857(金币+1): 鼓励回帖交流 2011-11-08 17:06:41
我只能回答一下第一个问题，其余的两个没有做过，也不清楚。
一般来说，鉴定细菌常用16SrDNA 来构建系统发育树，如果想要进一步明确分类地位，可以基于一些持家基因来构建发育树，然后综合考虑其分类归属。
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Thatislife,onlylifehurts.
2楼2011-11-08 16:21:44
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niyq

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
zhang8826857(金币+2): good 2011-11-09 09:05:01
1.16s、持家基因都可建树，关键数据库中要有先进序列
2.第二个问题前面和第一个问题一样，关键是你p出来的基因别人也研究过，有较多的相近序列，构建文库后测序，你才能比对，否则自己跟自己比吧，所以要选对基因，你要研究那类微生物，批出来克隆了，测序了或者酶切完了，统计相同的序列，你就知道哪些是优势菌了
3.选择载体上的链接位点两侧的序列就可以直接用大肠杆菌煮沸液做模板扩增
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3楼2011-11-09 00:40:06
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candice_fly

新虫 (初入文坛)
★ ★ ★ ★ ★ ★
zhang8826857(金币+6): 鼓励新虫+热心应助奖励 2011-11-14 15:56:29
引用回帖:
4楼: Originally posted by pcl-bunny at 2011-11-09 00:58:27:
楼主，您好。关于您的问题我有一些见解，建库有很多种,可以建细菌全基因组文库，也可以建某功能基因文库，还可以建16S文库等......您应该是想建16S文库做微生物分子生态吧！如果是统计多样性，研究群落结构，进化 ...

看了你的回帖，我说一下我的实验，希望你能指导一下。
我就是用的27F和1492R，我做了一次温度梯度，52度的条带没出，46度的还行，没有特异性。你做连接是跑电泳回收的片段，还是PCR扩出来的直接做连接？我连接了PMD-18，直接涂的AMP平板，菌落长的不多，可能没弄好，是不是用PMD-19比较好？
后面的  再用蓝白斑筛选（涂菌至含X-GEL和AMP的平板），挑取白斑（阳性）同时转板，用M13扩增做菌落PCR,酶切分型跑PAGE胶，分型后，挑取代表克隆子测序构建进化树。 能在详细说下么 ？谢谢了
酶切就是分出的条带不一样，然后在挑取群落的菌送测么？
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5楼2011-11-14 12:06:59
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pcl-bunny

木虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
zhang8826857(金币+5): good 2011-11-15 14:04:02
1>大约看了一下你的实验情况，如果做了降落PCR没有条带，可能是起始温度过高，你可以试试54度。
2>至于52度退火是我们实验室一直用的，从未出现无法扩增的情况，你还是看看体系有没有问题。下面是我建议的程序和体系：程序：94度，4分钟预变性；94度，30秒，变性；52度，30秒，退火；72度，1分30秒，延伸；30循环，72度，10分钟，终极延伸；10度，10分钟，保温。25微体系：buffer，2.5微；1xdNTP，2.5微；Mg+，2.5微；引物1、2各0.5微；DNA模板0.5~1.0微；Taq酶，0.2微；灭菌水补至25微。
3>如果涂AMP板，载体用PMD19-T和用18-T没差别，只是蓝白斑筛选时19-T高效点。
4>克隆完成后，挑菌做菌落PCR，引物为M13，退火60度，延伸1分40秒。然后用酶切（XSP、Hhal1），跑PAGE，挑不同类型条带的克隆子测序。
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candice_fly
NOPAIN,NOGAIN!
6楼2011-11-15 13:16:07
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candice_fly

新虫 (初入文坛)
★ ★
送鲜花一朵
zhang8826857(金币+2): 鼓励交流 2011-11-16 09:50:32
引用回帖:
6楼: Originally posted by pcl-bunny at 2011-11-15 13:16:07:
1>大约看了一下你的实验情况，如果做了降落PCR没有条带，可能是起始温度过高，你可以试试54度。
2>至于52度退火是我们实验室一直用的，从未出现无法扩增的情况，你还是看看体系有没有问题。下面是我建议的 ...

太感谢了，我想问一下，你们PCR扩出目的片段做连接的话，是跑琼脂糖电泳回收,还是购买PCR产物纯化试剂盒直接纯化？
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7楼2011-11-16 09:24:00
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pcl-bunny

木虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

琼脂糖胶回收就好。
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NOPAIN,NOGAIN!
8楼2011-11-19 00:21:01
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南邮杨栋梁

银虫 (小有名气)
长见识了
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好好工作
9楼2011-11-19 22:45:31
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YJD落叶梧桐

新虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by niyq at 2011-11-09 00:40:06:
1.16s、持家基因都可建树，关键数据库中要有先进序列
2.第二个问题前面和第一个问题一样，关键是你p出来的基因别人也研究过，有较多的相近序列，构建文库后测序，你才能比对，否则自己跟自己比吧，所以要选对基因 ...

我想问下楼主，关于煮沸法做模板扩增是怎么做的啊？万分感谢
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10楼2011-11-19 22:52:56
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