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微生物多样性研究的几个问题
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1.所有的引物p出来的序列都可以建系统发育树吗 2.什么引物p出来的序列可用于建立基因文库啊 建立基因文库怎样分析哪种是优势菌群 3.连接转化选择阳性克隆进行扩增的步骤是什么 谢谢 |
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 生物 |
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pcl-bunny
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【答案】应助回帖
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zhang8826857(金币+5, MicEPI+1): 不错，鼓励新虫，加油哦^_^ 2011-11-09 09:05:28
zhang8826857(金币+5, MicEPI+1): 不错，鼓励新虫，加油哦^_^ 2011-11-09 09:05:28
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楼主，您好。关于您的问题我有一些见解，建库有很多种,可以建细菌全基因组文库，也可以建某功能基因文库，还可以建16S文库等......您应该是想建16S文库做微生物分子生态吧！如果是统计多样性，研究群落结构，进化地位和优势种群，建议答案如下： 1），16s适合做系统发育树，研究其进化地位，扩16S全长建议引物27F,1492R.(退火52度，延伸1分30秒)。 2），下面两个问题其实是一个答案：扩出16S后，酶连至PMD19-T载体，转化（导入感受态大肠杆菌种），再用蓝白斑筛选（涂菌至含X-GEL和AMP的平板），挑取白斑（阳性）同时转板，用M13扩增做菌落PCR,酶切分型跑PAGE胶，分型后，挑取代表克隆子测序构建进化树。 |
4楼2011-11-09 00:58:27
zhaoyu2881
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2楼2011-11-08 16:21:44
niyq
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3楼2011-11-09 00:40:06
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zhang8826857(金币+6): 鼓励新虫+热心应助奖励 2011-11-14 15:56:29
zhang8826857(金币+6): 鼓励新虫+热心应助奖励 2011-11-14 15:56:29
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看了你的回帖，我说一下我的实验，希望你能指导一下。 我就是用的27F和1492R，我做了一次温度梯度，52度的条带没出，46度的还行，没有特异性。你做连接是跑电泳回收的片段，还是PCR扩出来的直接做连接？我连接了PMD-18，直接涂的AMP平板，菌落长的不多，可能没弄好，是不是用PMD-19比较好？ 后面的 再用蓝白斑筛选（涂菌至含X-GEL和AMP的平板），挑取白斑（阳性）同时转板，用M13扩增做菌落PCR,酶切分型跑PAGE胶，分型后，挑取代表克隆子测序构建进化树。 能在详细说下么 ？谢谢了 酶切就是分出的条带不一样，然后在挑取群落的菌送测么？ |
5楼2011-11-14 12:06:59
pcl-bunny
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【答案】应助回帖
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zhang8826857(金币+5): good 2011-11-15 14:04:02
zhang8826857(金币+5): good 2011-11-15 14:04:02
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1>大约看了一下你的实验情况，如果做了降落PCR没有条带，可能是起始温度过高，你可以试试54度。 2>至于52度退火是我们实验室一直用的，从未出现无法扩增的情况，你还是看看体系有没有问题。下面是我建议的程序和体系：程序：94度，4分钟预变性；94度，30秒，变性；52度，30秒，退火；72度，1分30秒，延伸；30循环，72度，10分钟，终极延伸；10度，10分钟，保温。25微体系：buffer，2.5微；1xdNTP，2.5微；Mg+，2.5微；引物1、2各0.5微；DNA模板0.5~1.0微；Taq酶，0.2微；灭菌水补至25微。 3>如果涂AMP板，载体用PMD19-T和用18-T没差别，只是蓝白斑筛选时19-T高效点。 4>克隆完成后，挑菌做菌落PCR，引物为M13，退火60度，延伸1分40秒。然后用酶切（XSP、Hhal1），跑PAGE，挑不同类型条带的克隆子测序。 |
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candice_fly6楼2011-11-15 13:16:07
7楼2011-11-16 09:24:00
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