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西门炊饼

铁虫 (初入文坛)

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专业: 病原细菌与放线菌生物学

[求助] 关于筛选和鉴定细菌(16S rRNA)

目前我的实验需要将样品中细菌分离出来并鉴定，希望能分离出我感兴趣的菌，如果能发现新细菌就更好了，对于如何筛选和鉴定，我有这样的难题：
感觉用Vitek-2自动分析仪鉴定菌工作量太大，而且费时间，首先得将样品用几种增菌液增菌，然后增菌液又划到几种筛选平板上，平板上挑单菌落划线，接种3代以上纯化，然后革兰氏染色（这步工作量大），最后拿去全自动微生物分析仪上去分析，鉴定卡贵，还不一定能全给鉴定出来，忒麻烦。往往一天要划上百块平板，如果做得多，更恐怖。
我的目的是筛菌，理想结果是筛到我感兴趣的菌，或者是新细菌。现在琢磨着用扩增16S rRNA，然后去测序的方法来筛菌，最后再拿去微生物自动分析，这样筛到新细菌的可能性大。我准备这么做，开始的步骤一样，首先得将样品用几种增菌液增菌，然后增菌液又划到几种筛选平板上，这时不挑单菌落纯化了，直接将筛选平板上的有代表性的单菌落（初步定为一块板10个左右，用以前的办法只能挑1-3个，不然工作量会吓死人）挑到盛有营养肉汤的EP管里去摇，摇好了后直接拿去菌液PCR，引物用16S rRNA的通用引物，扩增好了就送去测序。
不知道这样的方法是否可行，敬请高人指点，恳请大家畅所欲言。我知道这个方法存在的一个问题：首先，我挑到的单菌落有可能不是单种细菌，可能是两种甚至多种细菌，这样菌液PCR扩增出来的就不是一种片段，而是几种片段，由于我不太清楚测序的过程，这种情况下测序会测出什么结果我也无法预计。强调一点：我的目的是筛菌，不是一定要把每个都准确的测出来。

[ Last edited by 西门炊饼 on 2011-8-29 at 13:54 ]

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1楼 2011-08-29 13:45:39

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西门炊饼

铁虫 (初入文坛)

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引用回帖:

12楼: Originally posted by yemuren at 2011-08-31 10:38:35:
首先，我同意楼主先用16s来鉴定，一般情况下16s能鉴定到属，得到想要的后再用生理生化鉴定，工作量会小很多。但是，LZ的分子鉴定方法有待商榷，菌落不纯，或者不是单克隆，那么测序结果就会出现双峰或杂峰，这样的 ...

我是这么想的
如果先做生化鉴定：
比如说，用样品我划了一块板，假设这块板上有50个单克隆菌落，有20种菌，如果我一种菌都不想漏过，需要每个单克隆菌落都划板，需要划50块板，到最后需要做50个生化鉴定。如果我有10个样（当然远不止这么多），就得划2000+（50*10再纯化三代）块板，500次生化鉴定。这样的工作量和花费肯定不允许，那么我只能一个样挑15个左右单克隆划板，这样，很可能我错过了新细菌和我感兴趣的菌。

如果先扩增16S rRNA：同样地情况下，50个菌落我全部挑到EP管里摇菌，最后测序，保留菌液，分析测序结果后，筛选需要的菌，保留的菌液再去划线做生化鉴定。虽然没经过纯化三代，也许里面有相当一部分不纯，但也比挑10个划线得到的菌多，更完整。