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sxxuan金虫 (著名写手)
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PCR是阳性但酶切是阴性，怎么回事？
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最近做一个菌液，是已经带有重组质粒的。这个经过PCR鉴定是阳性的，用PCR做杂交也没有问题，信号很强。 但是以这管菌放大摇菌后提取质粒，以质粒为模板的PCR产物来做杂交，信号就很弱甚至没有了。 于是重新划板摇菌提质粒，甚至重新做了克隆，以菌液或质粒为模板，PCR都能得到很亮的条带，但是酶切或杂交就是没有信号 请大家帮忙分析一下看看是怎么回事？杂交的实验我没涉及过啊，谢谢了谢谢了～ ps：可以肯定的是探针是没有问题的 |
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，要理解参考的含义哦 9楼2011-04-23 13:20:19
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sxxuan(金币+3): 2011-04-23 22:13:28
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首先，要认识到以下两点： 1，PCR鉴定 这个东西很容易有假阳性，并且很难避免 不要想着去避免假阳性。那是没办法的。 2，杂交这个东西也很容易有假阳性，我400bp的探针去做杂交，只要你的质粒量大（比如2微克什么的），都出会带，不管含不含目的片段，而且是十分的亮的带，原因是那个地方质粒量太大，非特异结合的。杂交只适合基因组DNA（个人理解，望斧正）。 3，酶切只能是在连接后初步检测是否有东西连进去了，但是不能说明连正确了，有很多非特异性的东西是不可以解释的，我曾经酶切对的，但是测序就不知道连得事啥。 针对以上问题，个人建议：小提后送去测序。确定完全无误了，才能大提。 |
10楼2011-04-23 14:56:44
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