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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » PCR是阳性但酶切是阴性，怎么回事？
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sxxuan

金虫 (著名写手)

[求助] PCR是阳性但酶切是阴性，怎么回事？

最近做一个菌液，是已经带有重组质粒的。这个经过PCR鉴定是阳性的，用PCR做杂交也没有问题，信号很强。
但是以这管菌放大摇菌后提取质粒，以质粒为模板的PCR产物来做杂交，信号就很弱甚至没有了。
于是重新划板摇菌提质粒，甚至重新做了克隆，以菌液或质粒为模板，PCR都能得到很亮的条带，但是酶切或杂交就是没有信号
请大家帮忙分析一下看看是怎么回事？杂交的实验我没涉及过啊，谢谢了谢谢了～
ps：可以肯定的是探针是没有问题的
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你的日子如何，你的力量也必如何！
1楼 2011-04-22 14:54:25
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elvias

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
西瓜(金币+2): good 2011-04-22 16:01:10
sxxuan(金币+1): 2011-04-22 20:08:04
PCR比较容易出假阳性结果的，质粒的鉴定还是要以酶切和测序为准。
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3楼2011-04-22 15:32:35
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶
★ ★
西瓜(金币+2): 鼓励交流 2011-04-22 17:38:14
有没有可能是PCR出来假阳性？条件和引物之类的不知道是不是早就摸索好了的，不然不至于酶切都切不动。
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流星来时我许了个愿，愿我有吃有喝还有舒服的猪圈。讨厌发帖前不搜索论坛重复发帖和仅把论坛当解决问题工具，久不看论坛一来就提问者，宁弃EPI和VIP也不回帖。
2楼2011-04-22 15:22:50
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bst5

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
西瓜(金币+3): 鼓励！ 2011-04-22 17:39:15
sxxuan(金币+3): 2011-04-22 20:09:07
首先你的PCR引物有没有Blast过，如果没有很可能你的PCR产物是非特异的扩增。第二，你的PCR模板用的是什么，DNA还是cDNA，可能你的引物扩出来的是内含子，cDNA的话建议RNA去完DNA再反转，这样比较保险。第三，引物设计最好是夸内含子的。纯属个人只谈，因为我之前也遇到过类似的问题，连接完了后，PCR和酶切都没有问题，结果测序一塌糊涂。呵呵，祝好运！
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4楼2011-04-22 16:54:49
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sxxuan

金虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by 冼亮淀粉酶 at 2011-04-22 15:22:50:
有没有可能是PCR出来假阳性？条件和引物之类的不知道是不是早就摸索好了的，不然不至于酶切都切不动。

嗯，PCR的条带也很亮，切不动的话可能是假阳性，为什么假阳性的带也可以怎么亮啊？
条件和引物都是按照以前的来做，引物这个克隆是比较早之前别人做的，当时成功
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你的日子如何，你的力量也必如何！
5楼2011-04-22 20:07:41
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