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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » PCR是阳性但酶切是阴性，怎么回事？
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sxxuan

金虫 (著名写手)

[求助] PCR是阳性但酶切是阴性，怎么回事？

最近做一个菌液，是已经带有重组质粒的。这个经过PCR鉴定是阳性的，用PCR做杂交也没有问题，信号很强。
但是以这管菌放大摇菌后提取质粒，以质粒为模板的PCR产物来做杂交，信号就很弱甚至没有了。
于是重新划板摇菌提质粒，甚至重新做了克隆，以菌液或质粒为模板，PCR都能得到很亮的条带，但是酶切或杂交就是没有信号
请大家帮忙分析一下看看是怎么回事？杂交的实验我没涉及过啊，谢谢了谢谢了～
ps：可以肯定的是探针是没有问题的
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你的日子如何，你的力量也必如何！
1楼 2011-04-22 14:54:25
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阿修罗Axuro

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
西瓜(金币+2): 鼓励交流 2011-04-23 14:59:05
sxxuan(金币+3): 2011-04-23 22:13:28
首先，要认识到以下两点：
1，PCR鉴定 这个东西很容易有假阳性，并且很难避免 不要想着去避免假阳性。那是没办法的。
2，杂交这个东西也很容易有假阳性，我400bp的探针去做杂交，只要你的质粒量大（比如2微克什么的），都出会带，不管含不含目的片段，而且是十分的亮的带，原因是那个地方质粒量太大，非特异结合的。杂交只适合基因组DNA（个人理解，望斧正）。
3，酶切只能是在连接后初步检测是否有东西连进去了，但是不能说明连正确了，有很多非特异性的东西是不可以解释的，我曾经酶切对的，但是测序就不知道连得事啥。

针对以上问题，个人建议：小提后送去测序。确定完全无误了，才能大提。
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10楼2011-04-23 14:56:44
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶
★ ★
西瓜(金币+2): 鼓励交流 2011-04-22 17:38:14
有没有可能是PCR出来假阳性？条件和引物之类的不知道是不是早就摸索好了的，不然不至于酶切都切不动。
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流星来时我许了个愿，愿我有吃有喝还有舒服的猪圈。讨厌发帖前不搜索论坛重复发帖和仅把论坛当解决问题工具，久不看论坛一来就提问者，宁弃EPI和VIP也不回帖。
2楼2011-04-22 15:22:50
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elvias

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
西瓜(金币+2): good 2011-04-22 16:01:10
sxxuan(金币+1): 2011-04-22 20:08:04
PCR比较容易出假阳性结果的，质粒的鉴定还是要以酶切和测序为准。
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3楼2011-04-22 15:32:35
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bst5

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
西瓜(金币+3): 鼓励！ 2011-04-22 17:39:15
sxxuan(金币+3): 2011-04-22 20:09:07
首先你的PCR引物有没有Blast过，如果没有很可能你的PCR产物是非特异的扩增。第二，你的PCR模板用的是什么，DNA还是cDNA，可能你的引物扩出来的是内含子，cDNA的话建议RNA去完DNA再反转，这样比较保险。第三，引物设计最好是夸内含子的。纯属个人只谈，因为我之前也遇到过类似的问题，连接完了后，PCR和酶切都没有问题，结果测序一塌糊涂。呵呵，祝好运！
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4楼2011-04-22 16:54:49
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