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sxxuan

金虫 (著名写手)

[求助] PCR是阳性但酶切是阴性,怎么回事?

最近做一个菌液,是已经带有重组质粒的。这个经过PCR鉴定是阳性的,用PCR做杂交也没有问题,信号很强。
但是以这管菌放大摇菌后提取质粒,以质粒为模板的PCR产物来做杂交,信号就很弱甚至没有了。
于是重新划板摇菌提质粒,甚至重新做了克隆,以菌液或质粒为模板,PCR都能得到很亮的条带,但是酶切或杂交就是没有信号
请大家帮忙分析一下看看是怎么回事?杂交的实验我没涉及过啊,谢谢了谢谢了~
ps:可以肯定的是探针是没有问题的
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你的日子如何,你的力量也必如何!
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sxxuan

金虫 (著名写手)

引用回帖:
Originally posted by bst5 at 2011-04-22 16:54:49:
首先你的PCR引物有没有Blast过,如果没有很可能你的PCR产物是非特异的扩增。第二,你的PCR模板用的是什么,DNA还是cDNA,可能你的引物扩出来的是内含子,cDNA的话建议RNA去完DNA再反转,这样比较保险。第三,引物 ...

谢谢!
引物什么的都不是我设计的,保存的菌种是阳性的,不管PCR还是酶切,杂交信号也很强。但是放大摇菌后提取质粒,PCR和酶切鉴定也是阳性,以质粒为模板做PCR,再做杂交,就没有信号了。
PCR模板是上述那个阳性菌,扩出来的应该是不对称的DNA
你的日子如何,你的力量也必如何!
7楼2011-04-22 20:12:33
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶

★ ★
西瓜(金币+2): 鼓励交流 2011-04-22 17:38:14
有没有可能是PCR出来假阳性?条件和引物之类的不知道是不是早就摸索好了的,不然不至于酶切都切不动。
流星来时我许了个愿,愿我有吃有喝还有舒服的猪圈。讨厌发帖前不搜索论坛重复发帖和仅把论坛当解决问题工具,久不看论坛一来就提问者,宁弃EPI和VIP也不回帖。
2楼2011-04-22 15:22:50
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elvias

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
西瓜(金币+2): good 2011-04-22 16:01:10
sxxuan(金币+1): 2011-04-22 20:08:04
PCR比较容易出假阳性结果的,质粒的鉴定还是要以酶切和测序为准。
3楼2011-04-22 15:32:35
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bst5

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
西瓜(金币+3): 鼓励! 2011-04-22 17:39:15
sxxuan(金币+3): 2011-04-22 20:09:07
首先你的PCR引物有没有Blast过,如果没有很可能你的PCR产物是非特异的扩增。第二,你的PCR模板用的是什么,DNA还是cDNA,可能你的引物扩出来的是内含子,cDNA的话建议RNA去完DNA再反转,这样比较保险。第三,引物设计最好是夸内含子的。纯属个人只谈,因为我之前也遇到过类似的问题,连接完了后,PCR和酶切都没有问题,结果测序一塌糊涂。呵呵,祝好运!
4楼2011-04-22 16:54:49
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