应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

Znn3bq.jpeg
小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 双酶切
131/2返回列表12下一页
查看: 2263  |  回复: 12
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

yeshui

铁虫 (小有名气)

[求助] 双酶切

我的片段与质粒连接后，转到DH5α中，后提质粒，进行双酶切验证，和PCR验证，PCR能出现目的条带，可是双酶切切不来是怎么回事呢？不解，请大家多多指教啊
回复此楼

» 猜你喜欢
1楼 2012-02-27 21:28:52
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
回帖置顶 ( 共有1个 )

快乐的小傻瓜

木虫 (著名写手)

女神
yeshui: 回帖置顶 2012-03-01 09:55:45
不连接的质粒也能p出来……什么原因呢？pcr阴性对照咋做啊
赞一下 回复此楼
怀一颗宽容的心去生活，再拥挤的世界也变得无限宽广，再平凡的人生也变得充满阳光。
11楼2012-02-29 22:15:25
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

麻花13

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
小丹木木(金币+1): 鼓励应助 2012-02-29 08:19:28
yeshui(金币+2): ★有帮助 2012-02-29 20:45:43
可能是假阳性，即在涂布的时候，将残留的为整合入载体的目的基因遗留在平板上（实际上这种可能性非常大），在挑去菌落的时候，将残留基因一同带入PCR体系中，由于PCR的高灵敏度，自然会出现目的条带。
建议重新设计一对鉴定引物，5'端为目的基因上游质粒上的一段序列，3'端为原来目的基因的3‘端，这样能有效鉴定出携带目的基因的克隆
赞一下(2人) 回复此楼
8楼2012-02-29 06:51:09
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
普通回帖

panda73

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
小丹木木(金币+2): 鼓励 2012-02-28 08:15:54
你的阳性克隆多吗？
如果所有的阳性克隆都是这个样，那么有可能是PCR假阳性（PCR验证时有阴性对照吗？）
或者你的克隆方案是否有问题，导致酶切连接后酶切位点消失？
如果有更详细的信息，可以再分析
赞一下 回复此楼

» 本帖已获得的红花（最新10朵）

yeshui
2楼2012-02-27 21:43:34
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

小丹木木

荣誉版主 (著名写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by panda73 at 2012-02-27 21:43:34:
你的阳性克隆多吗？
如果所有的阳性克隆都是这个样，那么有可能是PCR假阳性（PCR验证时有阴性对照吗？）
或者你的克隆方案是否有问题，导致酶切连接后酶切位点消失？
如果有更详细的信息，可以再分析

假阳性是经常出现的，所以多做几个吧，呵呵
赞一下 回复此楼
3楼2012-02-28 08:16:42
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

yeshui

铁虫 (小有名气)
送鲜花一朵
引用回帖:
2楼: Originally posted by panda73 at 2012-02-27 21:43:34:
你的阳性克隆多吗？
如果所有的阳性克隆都是这个样，那么有可能是PCR假阳性（PCR验证时有阴性对照吗？）
或者你的克隆方案是否有问题，导致酶切连接后酶切位点消失？
如果有更详细的信息，可以再分析

转化的LB板上克隆很少，而且都是在边上长的，进行菌落PCR筛选都是阳性，但是再划到含有抗生素的LB板上大多数不长，只有一个长了，我上述做的就是长的那个。菌落PCR是用片段引物筛的
赞一下 回复此楼
4楼2012-02-28 08:49:50
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

清风寨

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
yeshui(金币+1): 2012-02-28 15:43:07
应该是假阳性 我以前也遇到过几次这种情况 没办法 只能重新连接 转化 然后就好了 pcr 酶切都没问题了
赞一下 回复此楼
冷风过心变热
5楼2012-02-28 10:39:33
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

shangyufang

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
根据你的描述，是假阳性的概率较大，重新连接转化一次
赞一下 回复此楼
sunny
6楼2012-02-28 22:15:40
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

smilerion

银虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
用基因引物和载体引物PCR验证不是更好么。。
赞一下 回复此楼
7楼2012-02-28 23:45:27
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

yeshui

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
楼: Originally posted by smilerion at 2012-02-28 23:45:27:
用基因引物和载体引物PCR验证不是更好么。。

是啊
回复此楼
9楼2012-02-29 20:42:48
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

yeshui

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
楼: Originally posted by 麻花13 at 2012-02-29 06:51:09:
可能是假阳性，即在涂布的时候，将残留的为整合入载体的目的基因遗留在平板上（实际上这种可能性非常大），在挑去菌落的时候，将残留基因一同带入PCR体系中，由于PCR的高灵敏度，自然会出现目的条带。
建议重新设 ...

这种理论还是第一次听说，学习到知识了
赞一下 回复此楼
10楼2012-02-29 20:47:03
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 yeshui 的主题更新
131/2返回列表12下一页
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 0854调剂 +6 长弓傲 2026-04-09 6/300 2026-04-09 11:16 by 2451080013
[考研] 085600，321分求调剂 +18 大馋小子 2026-04-04 19/950 2026-04-09 10:07 by 猪会飞
[考研] 工科 267求调剂 +6 wanwan00 2026-04-02 8/400 2026-04-08 22:09 by 朱云虎202
[考研] 一志愿山东大学化学与化工学院材料与化工专硕，360分求调剂 +8 不愿透露姓名的� 2026-04-02 8/400 2026-04-08 20:12 by luoyongfeng
[考研] 一志愿电子科技大学085600材料与化工 329分求调剂 +11 Naiko 2026-04-04 11/550 2026-04-08 14:00 by wutongshun
[考研] 281求调剂 +10 椰子蘑菇 2026-04-06 10/500 2026-04-08 11:43 by zzucheup
[考研] 一志愿生物与医药，296分，求调剂 +14 66鹿 2026-04-03 16/800 2026-04-08 10:38 by tjzhao
[考研] 307求调剂 +14 超级伊昂大王 2026-04-06 14/700 2026-04-08 07:03 by 无际的草原
[考研] 一志愿南科大生物学297分，求调剂推荐 +8 Y-yyusx 2026-04-06 9/450 2026-04-07 19:38 by biomichael
[考研] 生物学363调剂求助 +7 fanzhang6666 2026-04-06 9/450 2026-04-07 17:37 by lijunpoly
[考研] 材料调剂 +11 一样YWY 2026-04-07 11/550 2026-04-07 15:13 by shdgaomin
[考研] 一志愿苏州大学材料工程（085601）专硕有科研经历三项国奖两个实用型专利一项省级立项 +11 大火山小火山 2026-04-05 11/550 2026-04-06 22:55 by yunlongyang
[考研] 求调剂 +5 小沢 2026-04-03 5/250 2026-04-06 22:45 by 875465
[考研] 085405软件工程301分求调剂，专硕可跨专业，四六级已过 +3 静静想想 2026-04-05 3/150 2026-04-06 15:23 by nepu_uu
[考研] 070300化学学硕311分求调剂 +11 梁富贵险中求 2026-04-04 13/650 2026-04-06 07:24 by houyaoxu
[考研] 求调剂到0856材料工程 +3 程9915 2026-04-05 3/150 2026-04-05 18:15 by 蓝云思雨
[考研] 271分求调剂学校 +12 zph158488！ 2026-04-02 13/650 2026-04-05 10:13 by lqwchd
[考研] 男生，一志愿沪9生物学071000，初试308求调剂 +3 刘墨墨 2026-04-04 3/150 2026-04-05 08:26 by barlinike
[考研] 能动调剂326专硕 +4 wan112233 2026-04-04 4/200 2026-04-04 22:47 by yu221
[考研] 一志愿安徽大学0817化学工程与技术，求调剂 +14 我不是只因 2026-04-02 15/750 2026-04-03 09:49 by 蓝云思雨
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭