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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 双酶切
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yeshui

铁虫 (小有名气)

[求助] 双酶切

我的片段与质粒连接后，转到DH5α中，后提质粒，进行双酶切验证，和PCR验证，PCR能出现目的条带，可是双酶切切不来是怎么回事呢？不解，请大家多多指教啊
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1楼2012-02-27 21:28:52
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回帖置顶 ( 共有1个 )

快乐的小傻瓜

木虫 (著名写手)

女神
yeshui: 回帖置顶 2012-03-01 09:55:45
不连接的质粒也能p出来……什么原因呢？pcr阴性对照咋做啊
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怀一颗宽容的心去生活，再拥挤的世界也变得无限宽广，再平凡的人生也变得充满阳光。
11楼2012-02-29 22:15:25
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麻花13

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
小丹木木(金币+1): 鼓励应助 2012-02-29 08:19:28
yeshui(金币+2): ★有帮助 2012-02-29 20:45:43
可能是假阳性，即在涂布的时候，将残留的为整合入载体的目的基因遗留在平板上（实际上这种可能性非常大），在挑去菌落的时候，将残留基因一同带入PCR体系中，由于PCR的高灵敏度，自然会出现目的条带。
建议重新设计一对鉴定引物，5'端为目的基因上游质粒上的一段序列，3'端为原来目的基因的3‘端，这样能有效鉴定出携带目的基因的克隆
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8楼2012-02-29 06:51:09
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普通回帖

panda73

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
小丹木木(金币+2): 鼓励 2012-02-28 08:15:54
你的阳性克隆多吗？
如果所有的阳性克隆都是这个样，那么有可能是PCR假阳性（PCR验证时有阴性对照吗？）
或者你的克隆方案是否有问题，导致酶切连接后酶切位点消失？
如果有更详细的信息，可以再分析
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yeshui
2楼2012-02-27 21:43:34
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小丹木木

荣誉版主 (著名写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by panda73 at 2012-02-27 21:43:34:
你的阳性克隆多吗？
如果所有的阳性克隆都是这个样，那么有可能是PCR假阳性（PCR验证时有阴性对照吗？）
或者你的克隆方案是否有问题，导致酶切连接后酶切位点消失？
如果有更详细的信息，可以再分析

假阳性是经常出现的，所以多做几个吧，呵呵
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3楼2012-02-28 08:16:42
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yeshui

铁虫 (小有名气)
送鲜花一朵
引用回帖:
2楼: Originally posted by panda73 at 2012-02-27 21:43:34:
你的阳性克隆多吗？
如果所有的阳性克隆都是这个样，那么有可能是PCR假阳性（PCR验证时有阴性对照吗？）
或者你的克隆方案是否有问题，导致酶切连接后酶切位点消失？
如果有更详细的信息，可以再分析

转化的LB板上克隆很少，而且都是在边上长的，进行菌落PCR筛选都是阳性，但是再划到含有抗生素的LB板上大多数不长，只有一个长了，我上述做的就是长的那个。菌落PCR是用片段引物筛的
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4楼2012-02-28 08:49:50
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清风寨

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
yeshui(金币+1): 2012-02-28 15:43:07
应该是假阳性 我以前也遇到过几次这种情况 没办法 只能重新连接 转化 然后就好了 pcr 酶切都没问题了
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冷风过心变热
5楼2012-02-28 10:39:33
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shangyufang

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
根据你的描述，是假阳性的概率较大，重新连接转化一次
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sunny
6楼2012-02-28 22:15:40
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smilerion

银虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
用基因引物和载体引物PCR验证不是更好么。。
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7楼2012-02-28 23:45:27
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yeshui

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
楼: Originally posted by smilerion at 2012-02-28 23:45:27:
用基因引物和载体引物PCR验证不是更好么。。

是啊
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9楼2012-02-29 20:42:48
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yeshui

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
楼: Originally posted by 麻花13 at 2012-02-29 06:51:09:
可能是假阳性，即在涂布的时候，将残留的为整合入载体的目的基因遗留在平板上（实际上这种可能性非常大），在挑去菌落的时候，将残留基因一同带入PCR体系中，由于PCR的高灵敏度，自然会出现目的条带。
建议重新设 ...

这种理论还是第一次听说，学习到知识了
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10楼2012-02-29 20:47:03
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