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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 易错PCR酶切与连接
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shiqili471

金虫 (小有名气)
引用回帖:
10楼: Originally posted by huangrui1988 at 2014-11-01 23:33:59
是的，酶切位点突变概率明显比你低。另外你需要经过酶切之后胶回收的，大小变化正确的，你才回收，这样还错，那就天意啊。...

求教一下，易错PCR，酶切位点设计在引物上的，引物上的碱基也可能突变掉？
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11楼2014-11-02 15:24:03
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2583929432

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
这个还真不知道，不好意思。

[ 发自小木虫客户端 ]
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12楼2014-11-02 15:58:14
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caihang

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
必须要批评你，做了大半年连接，感觉你连问题的关键都没找到。
1，你确定是酶切效果不好吗？你用这两种酶分别单酶切，然后用单酶切回收的质粒做转化，看有没有长菌，有就是酶切不行。
2，xho 1这个酶切位点你查过没有。它好像是平滑连接末端，而Bamh1是粘性末端，两头的连接效率是不对等的，导致连接效率较两个粘性末端的要低很多，你可以尝试用Solution1做连接，每次多做几个，多设几个比例。
3，实在连不上，试试一步法连接试剂盒吧。
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13楼2014-11-02 16:03:09
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huangrui1988

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
11楼: Originally posted by shiqili471 at 2014-11-02 15:24:03
求教一下，易错PCR，酶切位点设计在引物上的，引物上的碱基也可能突变掉？...

是的，我知道这个很难相信。应该这么说，他不是帮你突变，是帮你把结构弄得乱七八糟。最后让你不好切。
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14楼2014-11-02 23:39:17
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neer

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
13楼: Originally posted by caihang at 2014-11-02 16:03:09
必须要批评你，做了大半年连接，感觉你连问题的关键都没找到。
1，你确定是酶切效果不好吗？你用这两种酶分别单酶切，然后用单酶切回收的质粒做转化，看有没有长菌，有就是酶切不行。
2，xho 1这个酶切位点你查过 ...

我也很着急。我已经请教了老师和同学，他们也都不知道问题出在哪。
1、质粒单切我都做过，是可以切开质粒的，这点是验证过的。
2、BamHI和Xhol这两种酶，FD和NEB的牌子我都试过，效果还是不好。NEB的技术支持说这两种酶是很常用的酶，应该不会有问题。
3、Solution 1我也试过，用的TAKARA连接试剂盒，阳性转化子也很少。
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15楼2014-11-03 09:40:48
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shiqili471

金虫 (小有名气)
引用回帖:
14楼: Originally posted by huangrui1988 at 2014-11-02 23:39:17
是的，我知道这个很难相信。应该这么说，他不是帮你突变，是帮你把结构弄得乱七八糟。最后让你不好切。...

受教了
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16楼2014-11-03 11:03:20
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caihang

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
15楼: Originally posted by neer at 2014-11-03 09:40:48
我也很着急。我已经请教了老师和同学，他们也都不知道问题出在哪。
1、质粒单切我都做过，是可以切开质粒的，这点是验证过的。
2、BamHI和Xhol这两种酶，FD和NEB的牌子我都试过，效果还是不好。NEB的技术支持说这 ...

我所谓的连接试剂盒是同源重组试剂盒，现在很多公司都有，试试看，需要重新合成引物，
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17楼2014-11-03 11:59:50
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caihang

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

如果你有TAKARA的产品目录，请看第A-42面：因该酶切出的突出末端比一般的4个碱基突出末端连接效率低，所以必须使用平滑末端的连接条件。
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18楼2014-11-03 12:04:55
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hihe99

银虫 (小有名气)
话说clontech有个in-fusion cloning 的试剂盒，不用考虑酶切位点，但是好像有点贵。不过我正在尝试一篇文章上的类似方法，正在做pcr验证。。。希望可以有效啊啊啊~~~

ps: 文章题目One-step sequence- and ligation-independent cloning (SLIC): Rapid and versatile cloning method for functional genomics studies，Jae-Yeon Jeong etal， 文章的Supplementary Protocol就是方法
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19楼2014-11-03 12:52:51
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水-水

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

可以试试分步酶切，我现在做的实验跟你的一样，可以交流交流。前段时间用了一下Chontech 的PCR Random Mutagenesis Kit 还不错，就是太贵6000.00元30次。
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20楼2015-03-25 21:13:45
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