【答案】应助回帖

11楼2014-11-02 15:24:03

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金虫 (著名写手)

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【答案】应助回帖

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这个还真不知道，不好意思。

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12楼2014-11-02 15:58:14

caihang

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【答案】应助回帖

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必须要批评你，做了大半年连接，感觉你连问题的关键都没找到。
1，你确定是酶切效果不好吗？你用这两种酶分别单酶切，然后用单酶切回收的质粒做转化，看有没有长菌，有就是酶切不行。
2，xho 1这个酶切位点你查过没有。它好像是平滑连接末端，而Bamh1是粘性末端，两头的连接效率是不对等的，导致连接效率较两个粘性末端的要低很多，你可以尝试用Solution1做连接，每次多做几个，多设几个比例。
3，实在连不上，试试一步法连接试剂盒吧。

13楼2014-11-02 16:03:09

huangrui1988

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11楼: Originally posted by shiqili471 at 2014-11-02 15:24:03
求教一下，易错PCR，酶切位点设计在引物上的，引物上的碱基也可能突变掉？...

是的，我知道这个很难相信。应该这么说，他不是帮你突变，是帮你把结构弄得乱七八糟。最后让你不好切。

14楼2014-11-02 23:39:17

neer

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引用回帖:

13楼: Originally posted by caihang at 2014-11-02 16:03:09
必须要批评你，做了大半年连接，感觉你连问题的关键都没找到。
1，你确定是酶切效果不好吗？你用这两种酶分别单酶切，然后用单酶切回收的质粒做转化，看有没有长菌，有就是酶切不行。
2，xho 1这个酶切位点你查过 ...

我也很着急。我已经请教了老师和同学，他们也都不知道问题出在哪。
1、质粒单切我都做过，是可以切开质粒的，这点是验证过的。
2、BamHI和Xhol这两种酶，FD和NEB的牌子我都试过，效果还是不好。NEB的技术支持说这两种酶是很常用的酶，应该不会有问题。
3、Solution 1我也试过，用的TAKARA连接试剂盒，阳性转化子也很少。

15楼2014-11-03 09:40:48

shiqili471

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引用回帖:

14楼: Originally posted by huangrui1988 at 2014-11-02 23:39:17
是的，我知道这个很难相信。应该这么说，他不是帮你突变，是帮你把结构弄得乱七八糟。最后让你不好切。...

受教了

16楼2014-11-03 11:03:20

caihang

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引用回帖:

15楼: Originally posted by neer at 2014-11-03 09:40:48
我也很着急。我已经请教了老师和同学，他们也都不知道问题出在哪。
1、质粒单切我都做过，是可以切开质粒的，这点是验证过的。
2、BamHI和Xhol这两种酶，FD和NEB的牌子我都试过，效果还是不好。NEB的技术支持说这 ...

我所谓的连接试剂盒是同源重组试剂盒，现在很多公司都有，试试看，需要重新合成引物，

17楼2014-11-03 11:59:50

caihang

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【答案】应助回帖

如果你有TAKARA的产品目录，请看第A-42面：因该酶切出的突出末端比一般的4个碱基突出末端连接效率低，所以必须使用平滑末端的连接条件。

18楼2014-11-03 12:04:55

hihe99

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话说clontech有个in-fusion cloning 的试剂盒，不用考虑酶切位点，但是好像有点贵。不过我正在尝试一篇文章上的类似方法，正在做pcr验证。。。希望可以有效啊啊啊~~~

ps: 文章题目One-step sequence- and ligation-independent cloning (SLIC): Rapid and versatile cloning method for functional genomics studies，Jae-Yeon Jeong etal，文章的Supplementary Protocol就是方法

19楼2014-11-03 12:52:51

水-水

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【答案】应助回帖

可以试试分步酶切，我现在做的实验跟你的一样，可以交流交流。前段时间用了一下Chontech 的PCR Random Mutagenesis Kit 还不错，就是太贵6000.00元30次。

20楼2015-03-25 21:13:45