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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » Sac1和Xho1的双酶切连接
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33ggdf

新虫 (小有名气)

[求助] Sac1和Xho1的双酶切连接

我在做Sac1和Xho1的双酶切连接，分别用这两个酶对表达载体和T载体进行双酶切3h（NEB的酶 ），T载体上我还加了保护碱基，然后分别切胶回收表达载体的大片段和T载体上的目的片段（两个片段都很亮，大小也合适，大片段约16k，目的片段1100bp）,大片段浓度是150纳克/微升，小片段是33纳克/微升，然后做连接（连接是用的promega的T4连接酶，16度16小时 22度3小时 4度过夜都试过），共20微升体系（2微升连接酶，2微升10×连接buffer， 共做了三个比例即大片段与目的片段两者的摩尔比是1:6  1:10   和1:15），再进行热击转化涂皿，分别做了阳性对照即空载体（长很多单菌落）和阴性对照（无单菌落）可以证明感受态及转化过程没问题，双酶切也成功。可为什么我的连接反应却一个单菌落也长不出来呢（抗性和浓度也没问题），哪位高人帮帮忙？？？最近快烦死了。。。。。
还有几个疑问：
                    1 难道是我的载体和片段的浓度不高还是太高，浓度是多少才合适呢？
                    2 不好连接是不是因为我的载体太大的原因
                    3 难道要我分步酶切吗？
                    4 求帮助啊啊啊。。。
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1楼 2013-09-13 16:10:37
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yudaoqian88

至尊木虫 (知名作家)

不良人

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+10, 鼓励回帖交流！ 2013-09-14 02:02:26
gyesang: 回帖置顶 2013-09-14 02:02:45
33ggdf: 金币+6, ★★★很有帮助 2013-09-14 10:06:35
我之前也遇到同样的问题，而且要比楼主的还要严重。PCR扩增三个片段，TA克隆连了三个月才有阳性克隆，后来同样用这样的方法分步酶切、回收、连接，构建表达载体。多次都没有成功。也就找各种原因，回收浓度，连接比例，时间，温度，酶切是否完全都感觉是问题的所在，一直重复也没有结果，现在我可以很有理由的告诉你，是胶回收过程影响了连接反应（我们用QIAGEN的盒子，也不行），采用一步法连接就好了：
1：如果你的目标载体的抗性和T载体不同，就好办了。抽提重组质粒和目标载体质粒，按照3:1-8:1的比例T质粒和目标载体，配制酶切体系，然后酒精沉淀回收，直接作为混合物配制连接体系。
2：如果抗性一样，同样参照上述方法，只是要大量降低两种质粒的用量。可以分别将重组质粒和载体分别配制体系进行酶切，然后混合，酒精沉淀，其他同上。
3大量挑取克隆，采用菌液PCR法或根据重组质粒大小不同，采用酶切法鉴定重组子（质粒小量粗提，自己配制试剂，很方便），1号菌斑少，阳性率高。2号抗性一致，需要根据3所述情况分级筛选。
4PCR鉴定的阳性克隆，可再通过质粒酶切检测进一步鉴定。

具体方案可参考我的硕士论文，里面有相同的筛选策略<<亚洲棉种皮特异性启动子的克隆及表达载体构建>>

希望对你有所帮助，祝好！此外，我也是新手，大家相互学习哈！
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特别喜欢家门口开门的瞬间，宝宝那个高兴呀，蹦蹦跳跳，好不热闹！
4楼2013-09-13 23:54:43
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yudaoqian88

至尊木虫 (知名作家)

不良人

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
gyesang: 金币+3, 鼓励回帖交流！ 2013-09-14 02:02:37
gyesang: 回帖置顶 2013-09-14 02:02:43
33ggdf: 金币+3 2013-09-14 10:05:59
1 凝胶回收片段可能会影响后续连接实验；
2 传统构建方法无法成功的情况下，可使用直接法，及酶切产物酒精沉淀法，可提高连接效率，但工作量较大；
3 使用in fusion技术，可以提高连接效率，减少工作量
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  • 附件 1 : 亚洲棉种皮特异启动子的克隆及表达载体构建.pdf
    • 2013-09-14 00:04:55, 1.92 M
特别喜欢家门口开门的瞬间，宝宝那个高兴呀，蹦蹦跳跳，好不热闹！
5楼2013-09-14 00:07:45
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白菜吃虫

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
33ggdf: 金币+2 2013-09-25 20:48:16
gyesang: 金币+3, 鼓励回帖交流！ 2013-09-26 15:07:45
gyesang: 回帖置顶 2013-09-26 15:07:47
1. 分别用这两个酶做下单酶切验证，包括载体和片段，确定酶切位点没有问题。
2. 如果确定酶切没有问题，双酶切回收后的产物用1—2ul 跑下电泳看下，片段是否回收。
3. 鉴于载体片段很大，因此可以再加大小片段的量，提高比例到1:100都没问题（浓缩下片段）。另外换个酶连接，防止酶失效。
4. 在后期鉴定的时候最好在载体两端找引物进行PCR鉴定，或者找载体上的酶切位点鉴定，防止多拷贝插入。
5. 建议加一个载体片段自连的阴性对照。
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6楼2013-09-25 19:07:43
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普通回帖

RUI1990

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖应助！ 2013-09-14 01:48:36
33ggdf: 金币+2 2013-09-14 10:05:45
你再仔细按照连接酶说明书上的要求，计算一下载体片段和目的片段的加量，有可能这里出现问题，还有会不会是涂板过程出了问题？
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做自己
2楼2013-09-13 16:22:32
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hl16010921

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2013-09-13 16:32:22
33ggdf: 金币+2 2013-09-14 10:05:31
1.建议加大T4的用量。LZ所做的应该是连接产物太少，那么要么延长连接时间，我做过4度连一周的。要么加大T4用量。比例应该可以了。2。转化时20ul全加进去。3.转化后摇菌再久一些。
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3楼2013-09-13 16:26:00
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