应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » Xho1和EcoR1双酶切，切不开
北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
151/2返回列表12下一页
查看: 3913  |  回复: 14
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

牧歌ping

铜虫 (小有名气)

[求助] Xho1和EcoR1双酶切，切不开

我的目的片段是400bp左右，两端引入Xho1和EcoR1酶切位点，它们有共用的H buffer，双酶切怎么都切不开，单个酶切却都能切开；分别先一个酶切后乙醇沉淀，再另一个酶切，仍然切不开，很郁闷！
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2012-11-06 11:21:55
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

牧歌ping

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by jiangyinshen at 2012-11-06 12:02:44
体系需要优化，酶切时间要延长，最好过夜，再做不出来的话就换试剂了

谢谢！就按照酶的说明书写的体系做的，酶切过夜也还是没切开，Takara的酶
赞一下(1人) 回复此楼
6楼2012-11-06 15:17:07
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
普通回帖

475502411

铜虫 (著名写手)
他们有公用的Buffer，但是在这个公用Buffer中的活性怎么样？如果活性太低的话要延长酶切时间的。
其实单酶切是可以的，不用醇沉，我经常做
你先用一个酶切，然后不要跑胶直接回收
然后再有另外一个酶切
都选他们活性最高的Buffer
第二个酶切后再跑胶回收
这样是不会有任何问题的应该就能切开了
但是要保证你的浓度，用第一个酶切的时候可以多做两管，用一个柱子回收，然后再用少量的洗脱液洗脱就好了、
祝你顺利
赞一下 回复此楼
可以朝九晚五，也能浪迹天涯
2楼2012-11-06 11:29:31
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

jiangyinshen

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
牧歌ping: 金币+1, ★有帮助 2012-11-07 09:28:10
体系需要优化，酶切时间要延长，最好过夜，再做不出来的话就换试剂了
赞一下 回复此楼
不是風動，亦非幡動，仁者心動
3楼2012-11-06 12:02:44
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

zhlf1989513

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
牧歌ping: 金币+2 2012-11-07 09:28:02
楼主的目的片段怎么得来的？PCR然后胶回收吗？如果是胶回收的话，胶回收过程的乙醇对酶切影响很大，乙醇一定要挥发干。。。
赞一下 回复此楼
keepon
4楼2012-11-06 14:02:30
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

牧歌ping

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 475502411 at 2012-11-06 11:29:31
他们有公用的Buffer，但是在这个公用Buffer中的活性怎么样？如果活性太低的话要延长酶切时间的。
其实单酶切是可以的，不用醇沉，我经常做
你先用一个酶切，然后不要跑胶直接回收
然后再有另外一个酶切
都选他们 ...

两个酶的buffer都是H buffer，是它们活性最高的buffer。我每次至少做2管平行，一般酶切2~3h,最长切过夜了，可还是没有完全切开，感觉两个酶加一起有一个失活一样。如果不用醇沉，第二个酶切这个体系怎么弄啊？谢谢！
赞一下 回复此楼
5楼2012-11-06 15:15:57
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

牧歌ping

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by zhlf1989513 at 2012-11-06 14:02:30
楼主的目的片段怎么得来的？PCR然后胶回收吗？如果是胶回收的话，胶回收过程的乙醇对酶切影响很大，乙醇一定要挥发干。。。

是质粒酶切，20ul的体系，0.5ul和1ul的质粒量都切过，单个酶分别都能切开，就是双切切不开
赞一下 回复此楼
7楼2012-11-06 15:18:24
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

475502411

铜虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-11-06 17:27:33
牧歌ping: 金币+7, ★★★很有帮助 2012-11-07 09:27:50
引用回帖:
5楼: Originally posted by 牧歌ping at 2012-11-06 15:15:57
两个酶的buffer都是H buffer，是它们活性最高的buffer。我每次至少做2管平行，一般酶切2~3h,最长切过夜了，可还是没有完全切开，感觉两个酶加一起有一个失活一样。如果不用醇沉，第二个酶切这个体系怎么弄啊？谢谢 ...

第二个酶切的体系和平时的酶切体系是一样的（如第一个）
没事的。就是第一次酶切的时候多切两管，回收的时候都加到一个柱子上，用25微升洗脱，这样第一次酶切后的浓度可以保证，把回收的都酶切了，再跑胶回收到一个柱子了
这样就可以了
试试
我都是这样做的
但是第一次不跑胶直接回收，但是第二次一定要跑胶回收
祝好
赞一下 回复此楼
可以朝九晚五，也能浪迹天涯
8楼2012-11-06 16:37:50
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

牧歌ping

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by 475502411 at 2012-11-06 16:37:50
第二个酶切的体系和平时的酶切体系是一样的（如第一个）
没事的。就是第一次酶切的时候多切两管，回收的时候都加到一个柱子上，用25微升洗脱，这样第一次酶切后的浓度可以保证，把回收的都酶切了，再跑胶回收到一 ...

25ul洗脱全部酶切，那总酶切体系是50ul？我们一般都是20ul酶切体系，平行多做几管
赞一下 回复此楼
9楼2012-11-06 16:49:15
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

牧歌ping

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by 475502411 at 2012-11-06 16:37:50
第二个酶切的体系和平时的酶切体系是一样的（如第一个）
没事的。就是第一次酶切的时候多切两管，回收的时候都加到一个柱子上，用25微升洗脱，这样第一次酶切后的浓度可以保证，把回收的都酶切了，再跑胶回收到一 ...

呵呵，懂了，刚一下没反应过来，25ul分为多管二次酶切是吧，谢谢了！
赞一下 回复此楼
10楼2012-11-06 16:51:34
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 牧歌ping 的主题更新
151/2返回列表12下一页
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 求调剂，一志愿厦门大学，生物与医药，总分272，本科211 +6 Electron1cc 2026-04-01 7/350 2026-04-07 13:19 by guanxin1001
[考研] 270分求调剂 +6 maxjxbsk 2026-04-01 6/300 2026-04-07 12:53 by flydream1314
[考研] 264求调剂 +7 麦小叮当 2026-04-07 7/350 2026-04-07 12:05 by Sammy2
[考研] 软工学硕299求调剂 +6 useryy 2026-04-07 6/300 2026-04-07 09:50 by vgtyfty
[考研] 一志愿上海海洋大学083200食品学硕，求调剂，接受其他专业 +9 what张 2026-04-01 11/550 2026-04-07 09:45 by momo皓
[考研] 277求调剂 数一104分 +9 瓶子PZ 2026-04-05 13/650 2026-04-06 23:48 by 蓝云思雨
[考研] 308求调剂 +11 墨墨漠 2026-04-06 11/550 2026-04-06 22:56 by 875465
[考研] 考研调剂 +3 Wwwwwww哇 2026-04-06 3/150 2026-04-06 20:55 by lbsjt
[考研] 一志愿武汉理工大学080200机械工程308分，求调剂 +4 终不似从前 2026-04-05 4/200 2026-04-06 11:46 by 考研学校招点人
[考研] 求调剂，一志愿郑州大学材料与化工专硕，英二数二342分，求老师收留 +19 v12abo 2026-04-02 21/1050 2026-04-06 09:29 by 蓝云思雨
[考研] 材料专硕(0856) 339分求调剂 +10 哈哈哈鹅哈哈哈 2026-04-04 10/500 2026-04-05 18:51 by 蓝云思雨
[考研] 材料调剂 +7 dxy调剂 2026-04-04 7/350 2026-04-05 09:15 by 陌秋26
[考研] 。 +5 雾与海 2026-04-02 6/300 2026-04-04 19:53 by 蓝云思雨
[考研] 求调剂，一志愿南京航空航天大学 ，080500材料科学与工程学硕 +10 @taotao 2026-04-03 10/500 2026-04-04 09:01 by T可可西里T
[考研] 282求调剂 +20 ycy1201 2026-04-01 22/1100 2026-04-04 00:42 by userper
[考研] 295求调剂 +3 尚偌呀 2026-04-03 4/200 2026-04-03 21:23 by zhq0425
[考研] 316求调剂 +14 舟自梗 2026-04-01 18/900 2026-04-03 10:28 by linyelide
[考研] 312 化工或制药调剂 +8 小小墨123 2026-04-02 9/450 2026-04-03 09:12 by zhouxiaoyu
[考研] 一志愿北京科技材料科学与工程288分，求调剂 +14 是辰啊 2026-04-02 14/700 2026-04-02 21:10 by dongzh2009
[考研] 283求调剂 +3 jiouuu 2026-04-02 4/200 2026-04-02 14:08 by 哒哒哒呱呱呱
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭