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北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
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牧歌ping

铜虫 (小有名气)

[求助] Xho1和EcoR1双酶切,切不开

我的目的片段是400bp左右,两端引入Xho1和EcoR1酶切位点,它们有共用的H buffer,双酶切怎么都切不开,单个酶切却都能切开;分别先一个酶切后乙醇沉淀,再另一个酶切,仍然切不开,很郁闷!
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牧歌ping

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
3楼: Originally posted by jiangyinshen at 2012-11-06 12:02:44
体系需要优化,酶切时间要延长,最好过夜,再做不出来的话就换试剂了

谢谢!就按照酶的说明书写的体系做的,酶切过夜也还是没切开,Takara的酶
6楼2012-11-06 15:17:07
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普通回帖

475502411

铜虫 (著名写手)

他们有公用的Buffer,但是在这个公用Buffer中的活性怎么样?如果活性太低的话要延长酶切时间的。
其实单酶切是可以的,不用醇沉,我经常做
你先用一个酶切,然后不要跑胶直接回收
然后再有另外一个酶切
都选他们活性最高的Buffer
第二个酶切后再跑胶回收
这样是不会有任何问题的应该就能切开了
但是要保证你的浓度,用第一个酶切的时候可以多做两管,用一个柱子回收,然后再用少量的洗脱液洗脱就好了、
祝你顺利
可以朝九晚五,也能浪迹天涯
2楼2012-11-06 11:29:31
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jiangyinshen

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
牧歌ping: 金币+1, 有帮助 2012-11-07 09:28:10
体系需要优化,酶切时间要延长,最好过夜,再做不出来的话就换试剂了
不是風動,亦非幡動,仁者心動
3楼2012-11-06 12:02:44
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zhlf1989513

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
牧歌ping: 金币+2 2012-11-07 09:28:02
楼主的目的片段怎么得来的?PCR然后胶回收吗?如果是胶回收的话,胶回收过程的乙醇对酶切影响很大,乙醇一定要挥发干。。。
keepon
4楼2012-11-06 14:02:30
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牧歌ping

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by 475502411 at 2012-11-06 11:29:31
他们有公用的Buffer,但是在这个公用Buffer中的活性怎么样?如果活性太低的话要延长酶切时间的。
其实单酶切是可以的,不用醇沉,我经常做
你先用一个酶切,然后不要跑胶直接回收
然后再有另外一个酶切
都选他们 ...

两个酶的buffer都是H buffer,是它们活性最高的buffer。我每次至少做2管平行,一般酶切2~3h,最长切过夜了,可还是没有完全切开,感觉两个酶加一起有一个失活一样。如果不用醇沉,第二个酶切这个体系怎么弄啊?谢谢!
5楼2012-11-06 15:15:57
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牧歌ping

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
4楼: Originally posted by zhlf1989513 at 2012-11-06 14:02:30
楼主的目的片段怎么得来的?PCR然后胶回收吗?如果是胶回收的话,胶回收过程的乙醇对酶切影响很大,乙醇一定要挥发干。。。

是质粒酶切,20ul的体系,0.5ul和1ul的质粒量都切过,单个酶分别都能切开,就是双切切不开
7楼2012-11-06 15:18:24
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475502411

铜虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-11-06 17:27:33
牧歌ping: 金币+7, ★★★很有帮助 2012-11-07 09:27:50
引用回帖:
5楼: Originally posted by 牧歌ping at 2012-11-06 15:15:57
两个酶的buffer都是H buffer,是它们活性最高的buffer。我每次至少做2管平行,一般酶切2~3h,最长切过夜了,可还是没有完全切开,感觉两个酶加一起有一个失活一样。如果不用醇沉,第二个酶切这个体系怎么弄啊?谢谢 ...

第二个酶切的体系和平时的酶切体系是一样的(如第一个)
没事的。就是第一次酶切的时候多切两管,回收的时候都加到一个柱子上,用25微升洗脱,这样第一次酶切后的浓度可以保证,把回收的都酶切了,再跑胶回收到一个柱子了
这样就可以了
试试
我都是这样做的
但是第一次不跑胶直接回收,但是第二次一定要跑胶回收
祝好
可以朝九晚五,也能浪迹天涯
8楼2012-11-06 16:37:50
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牧歌ping

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
8楼: Originally posted by 475502411 at 2012-11-06 16:37:50
第二个酶切的体系和平时的酶切体系是一样的(如第一个)
没事的。就是第一次酶切的时候多切两管,回收的时候都加到一个柱子上,用25微升洗脱,这样第一次酶切后的浓度可以保证,把回收的都酶切了,再跑胶回收到一 ...

25ul洗脱全部酶切,那总酶切体系是50ul?我们一般都是20ul酶切体系,平行多做几管
9楼2012-11-06 16:49:15
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牧歌ping

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
8楼: Originally posted by 475502411 at 2012-11-06 16:37:50
第二个酶切的体系和平时的酶切体系是一样的(如第一个)
没事的。就是第一次酶切的时候多切两管,回收的时候都加到一个柱子上,用25微升洗脱,这样第一次酶切后的浓度可以保证,把回收的都酶切了,再跑胶回收到一 ...

呵呵,懂了,刚一下没反应过来,25ul分为多管二次酶切是吧,谢谢了!
10楼2012-11-06 16:51:34
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