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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » Xho1和EcoR1双酶切，切不开
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牧歌ping

铜虫 (小有名气)

[求助] Xho1和EcoR1双酶切，切不开

我的目的片段是400bp左右，两端引入Xho1和EcoR1酶切位点，它们有共用的H buffer，双酶切怎么都切不开，单个酶切却都能切开；分别先一个酶切后乙醇沉淀，再另一个酶切，仍然切不开，很郁闷！
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1楼 2012-11-06 11:21:55
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牧歌ping

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by jiangyinshen at 2012-11-06 12:02:44
体系需要优化，酶切时间要延长，最好过夜，再做不出来的话就换试剂了

谢谢！就按照酶的说明书写的体系做的，酶切过夜也还是没切开，Takara的酶
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6楼2012-11-06 15:17:07
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普通回帖

475502411

铜虫 (著名写手)
他们有公用的Buffer，但是在这个公用Buffer中的活性怎么样？如果活性太低的话要延长酶切时间的。
其实单酶切是可以的，不用醇沉，我经常做
你先用一个酶切，然后不要跑胶直接回收
然后再有另外一个酶切
都选他们活性最高的Buffer
第二个酶切后再跑胶回收
这样是不会有任何问题的应该就能切开了
但是要保证你的浓度，用第一个酶切的时候可以多做两管，用一个柱子回收，然后再用少量的洗脱液洗脱就好了、
祝你顺利
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可以朝九晚五，也能浪迹天涯
2楼2012-11-06 11:29:31
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jiangyinshen

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
牧歌ping: 金币+1, ★有帮助 2012-11-07 09:28:10
体系需要优化，酶切时间要延长，最好过夜，再做不出来的话就换试剂了
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不是風動，亦非幡動，仁者心動
3楼2012-11-06 12:02:44
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zhlf1989513

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
牧歌ping: 金币+2 2012-11-07 09:28:02
楼主的目的片段怎么得来的？PCR然后胶回收吗？如果是胶回收的话，胶回收过程的乙醇对酶切影响很大，乙醇一定要挥发干。。。
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keepon
4楼2012-11-06 14:02:30
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牧歌ping

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 475502411 at 2012-11-06 11:29:31
他们有公用的Buffer，但是在这个公用Buffer中的活性怎么样？如果活性太低的话要延长酶切时间的。
其实单酶切是可以的，不用醇沉，我经常做
你先用一个酶切，然后不要跑胶直接回收
然后再有另外一个酶切
都选他们 ...

两个酶的buffer都是H buffer，是它们活性最高的buffer。我每次至少做2管平行，一般酶切2~3h,最长切过夜了，可还是没有完全切开，感觉两个酶加一起有一个失活一样。如果不用醇沉，第二个酶切这个体系怎么弄啊？谢谢！
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5楼2012-11-06 15:15:57
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牧歌ping

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by zhlf1989513 at 2012-11-06 14:02:30
楼主的目的片段怎么得来的？PCR然后胶回收吗？如果是胶回收的话，胶回收过程的乙醇对酶切影响很大，乙醇一定要挥发干。。。

是质粒酶切，20ul的体系，0.5ul和1ul的质粒量都切过，单个酶分别都能切开，就是双切切不开
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7楼2012-11-06 15:18:24
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475502411

铜虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
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小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-11-06 17:27:33
牧歌ping: 金币+7, ★★★很有帮助 2012-11-07 09:27:50
引用回帖:
5楼: Originally posted by 牧歌ping at 2012-11-06 15:15:57
两个酶的buffer都是H buffer，是它们活性最高的buffer。我每次至少做2管平行，一般酶切2~3h,最长切过夜了，可还是没有完全切开，感觉两个酶加一起有一个失活一样。如果不用醇沉，第二个酶切这个体系怎么弄啊？谢谢 ...

第二个酶切的体系和平时的酶切体系是一样的（如第一个）
没事的。就是第一次酶切的时候多切两管，回收的时候都加到一个柱子上，用25微升洗脱，这样第一次酶切后的浓度可以保证，把回收的都酶切了，再跑胶回收到一个柱子了
这样就可以了
试试
我都是这样做的
但是第一次不跑胶直接回收，但是第二次一定要跑胶回收
祝好
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可以朝九晚五，也能浪迹天涯
8楼2012-11-06 16:37:50
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牧歌ping

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by 475502411 at 2012-11-06 16:37:50
第二个酶切的体系和平时的酶切体系是一样的（如第一个）
没事的。就是第一次酶切的时候多切两管，回收的时候都加到一个柱子上，用25微升洗脱，这样第一次酶切后的浓度可以保证，把回收的都酶切了，再跑胶回收到一 ...

25ul洗脱全部酶切，那总酶切体系是50ul？我们一般都是20ul酶切体系，平行多做几管
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9楼2012-11-06 16:49:15
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牧歌ping

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by 475502411 at 2012-11-06 16:37:50
第二个酶切的体系和平时的酶切体系是一样的（如第一个）
没事的。就是第一次酶切的时候多切两管，回收的时候都加到一个柱子上，用25微升洗脱，这样第一次酶切后的浓度可以保证，把回收的都酶切了，再跑胶回收到一 ...

呵呵，懂了，刚一下没反应过来，25ul分为多管二次酶切是吧，谢谢了！
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10楼2012-11-06 16:51:34
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