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070250035

银虫 (小有名气)

[求助] 为什么单酶切切不开

最近最转基因用的Super1300载体,选HindIII和Spe1 酶双酶切后和目的片段连接,但是总是空载,自连,没办法,单酶切验证发现Spe1酶切不开,HindIII没问题,可以确定不是酶的问题,因为用别人切其他质粒没问题的Spe1酶切的,但是切我的空载都不行,另外想着换 酶切位点,拿其他酶试了一下,也能切开,但是SpeI就是切不开,和空载的条带一样!一直弄不明白怎么回事,我用的NEB酶,看NEB目录说这个酶对甲基化并不敏感啊,怎么回事啊???谁能救救我!
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探究知识的海洋
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
laozuzunzhe: 金币+3, 鼓励应助! 2013-04-11 17:21:33
有些酶对盐浓度比较敏感。一般提的质粒里可能会有一定盐分。你用的多少μl的酶切体系,质粒加了多少?一般可以扩大酶切体系的体积可以解决问题。
2楼2013-04-10 14:53:16
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tayifeita

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
载体上面那个位点是不是被甲基化了?或者是缓冲液有问题?

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
3楼2013-04-10 20:07:18
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070250035

银虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-04-10 14:53:16
有些酶对盐浓度比较敏感。一般提的质粒里可能会有一定盐分。你用的多少μl的酶切体系,质粒加了多少?一般可以扩大酶切体系的体积可以解决问题。

40微升体系加了5微升质粒,酶加1.5微升,切不开啊,我用试剂盒提的质粒,应该没问题吧???是Spe1酶有什么特殊的么??
探究知识的海洋
4楼2013-04-11 09:42:08
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070250035

银虫 (小有名气)

引用回帖:
3楼: Originally posted by tayifeita at 2013-04-10 20:07:18
载体上面那个位点是不是被甲基化了?或者是缓冲液有问题?

缓冲液是通用的,其他酶都问题,但是这个Spe1看NEB上说并不对甲基化敏感啊?
探究知识的海洋
5楼2013-04-11 09:43:13
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
4楼: Originally posted by 070250035 at 2013-04-11 09:42:08
40微升体系加了5微升质粒,酶加1.5微升,切不开啊,我用试剂盒提的质粒,应该没问题吧???是Spe1酶有什么特殊的么??...

确定质粒序列没有问题吗?会不会是突变了。
6楼2013-04-11 13:17:58
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wangwang2

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
应该从Super1300找原因了,可能酶切位点出问题了。
7楼2013-04-11 19:26:13
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070250035

银虫 (小有名气)

引用回帖:
7楼: Originally posted by wangwang2 at 2013-04-11 19:26:13
应该从Super1300找原因了,可能酶切位点出问题了。

换了载体果然成功了!
探究知识的海洋
8楼2013-04-21 16:40:48
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2298827423

银虫 (初入文坛)

引用回帖:
8楼: Originally posted by 070250035 at 2013-04-21 16:40:48
换了载体果然成功了!...

您是换了一管新的SP1300吗?我的为何换了几管都还是切不开?求回复,谢谢
9楼2016-08-14 17:34:29
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xingh119

禁虫 (正式写手)

本帖内容被屏蔽

10楼2016-08-14 18:20:29
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