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fannyzehong

银虫 (初入文坛)

[求助] 双酶切看不到小片段,为什么?

质粒双酶切看不到小片段,是怎么回事?是双酶切失败了吗?请各位大侠帮忙分析分析,谢谢!
泳道1:质粒;2:BamHI单酶切;3:NcoI单酶切;4:BamHI,NcoI双酶切
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回帖置顶 ( 共有1个 )

世外清风

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
silicare: 金币+5, BioEPI+1, 应助指数+1, 很重要的原因 2012-04-28 11:49:30
fannyzehong: 金币+1 2012-04-28 17:13:18
你酶切量太少了,可以看出你切出的小片段很小吧,他们是等摩尔比的,你的质粒好像有十几Kb了,你切出的可能只有100bp,这样一比100:1,按亮度来看,稀释100倍看不见很正常,建议扩大质粒的量,按比例算一一算,保证小片段至少也得几百ng吧,除去回收的损失,才有的用。祝好运!
7楼2012-04-28 10:15:41
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普通回帖

cxfans

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
我觉得是不是你用的酶切缓冲液不是两者兼容的 建议试一下连续单酶切试试,只是有点耗时
2楼2012-04-27 21:40:21
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第五平原

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
fannyzehong: 金币+1 2012-04-28 17:13:36
yqbter: 金币+1, 鼓励发帖交流! 2012-06-03 10:18:35
我自己在实验中也遇到过这种情况,双酶切后只能看到载体片段而看不见目标基因片段,据师兄说是因为如果载体的分子量是目标基因分子量的几百倍,同样拷贝数的情况下载体与基因的亮度也呈相应的比例,也就是说载体会远远亮于基因,不知道你具体试验中是什么情况,希望这个回答对你有所帮助
勤勉
3楼2012-04-27 22:33:07
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淘气维尼89

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
从图示来看,应该是切了一部分吧,毕竟模板质粒跑的最慢。但是你的三种酶怎么跑出的条带都在一条线上,是不是酶的活力不够,或是切出来的片段被破坏了,显示不出来?双酶切的Buffer估计不一样吧?
4楼2012-04-27 23:39:21
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kly312254857

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
你那单酶切怎么跑得比质粒还快?
5楼2012-04-27 23:53:11
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分子菜鸟

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
silicare: 金币+1, 不排除 2012-04-28 11:50:56
fannyzehong: 金币+1 2012-04-28 17:14:11
我觉得是片段太小了,所以亮度会很低。这图已经能证明切开了。
6楼2012-04-28 09:22:53
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tyw2623

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
silicare: 金币+1, 只能说一般是 2012-04-28 11:50:18
fannyzehong: 金币+1 2012-04-28 17:14:51
质粒酶切前比酶切后跑的要慢,这个不正确的 ,一般都是环状比线性的要快,,lz可做了菌液pcr?是阳性吗?
水遁
8楼2012-04-28 10:35:10
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世外清风

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖


fannyzehong: 金币+1 2012-04-28 17:14:21
引用回帖:
8楼: Originally posted by tyw2623 at 2012-04-28 10:35:10:
质粒酶切前比酶切后跑的要慢,这个不正确的 ,一般都是环状比线性的要快,,lz可做了菌液pcr?是阳性吗?

也有可能是开环的啊,就跑胶图来看应该是切开了,不论单酶切还是双酶切!
9楼2012-04-28 10:56:21
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tyw2623

金虫 (小有名气)

★ ★
yqbter: 金币+2, 感谢参与应助 2012-05-19 12:30:13
引用回帖:
9楼: Originally posted by 世外清风 at 2012-04-28 10:56:21:
也有可能是开环的啊,就跑胶图来看应该是切开了,不论单酶切还是双酶切!

如果是开环的话  应该和单酶切位置一样   单酶切不就是开环了  ?再说从菌液提取的质粒  有时候确实有开环的    但肯定也有环状的     如果没有这个质粒有什么用
水遁
10楼2012-04-28 14:07:26
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