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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 双酶切看不到小片段，为什么？
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fannyzehong

银虫 (初入文坛)

[求助] 双酶切看不到小片段，为什么？

质粒双酶切看不到小片段，是怎么回事？是双酶切失败了吗？请各位大侠帮忙分析分析，谢谢!
泳道1：质粒；2：BamHI单酶切；3：NcoI单酶切；4：BamHI,NcoI双酶切
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1楼 2012-04-27 17:29:12
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

世外清风

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
silicare: 金币+5, BioEPI+1, 应助指数+1, 很重要的原因 2012-04-28 11:49:30
fannyzehong: 金币+1 2012-04-28 17:13:18
你酶切量太少了，可以看出你切出的小片段很小吧，他们是等摩尔比的，你的质粒好像有十几Kb了，你切出的可能只有100bp,这样一比100：1，按亮度来看，稀释100倍看不见很正常，建议扩大质粒的量，按比例算一一算，保证小片段至少也得几百ng吧，除去回收的损失，才有的用。祝好运！
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7楼2012-04-28 10:15:41
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普通回帖

cxfans

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
我觉得是不是你用的酶切缓冲液不是两者兼容的 建议试一下连续单酶切试试，只是有点耗时
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2楼2012-04-27 21:40:21
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第五平原

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
fannyzehong: 金币+1 2012-04-28 17:13:36
yqbter: 金币+1, 鼓励发帖交流！ 2012-06-03 10:18:35
我自己在实验中也遇到过这种情况，双酶切后只能看到载体片段而看不见目标基因片段，据师兄说是因为如果载体的分子量是目标基因分子量的几百倍，同样拷贝数的情况下载体与基因的亮度也呈相应的比例，也就是说载体会远远亮于基因，不知道你具体试验中是什么情况，希望这个回答对你有所帮助
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勤勉
3楼2012-04-27 22:33:07
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淘气维尼89

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
从图示来看，应该是切了一部分吧，毕竟模板质粒跑的最慢。但是你的三种酶怎么跑出的条带都在一条线上，是不是酶的活力不够，或是切出来的片段被破坏了，显示不出来？双酶切的Buffer估计不一样吧？
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4楼2012-04-27 23:39:21
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kly312254857

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你那单酶切怎么跑得比质粒还快？
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5楼2012-04-27 23:53:11
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分子菜鸟

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
silicare: 金币+1, 不排除 2012-04-28 11:50:56
fannyzehong: 金币+1 2012-04-28 17:14:11
我觉得是片段太小了，所以亮度会很低。这图已经能证明切开了。
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6楼2012-04-28 09:22:53
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tyw2623

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
silicare: 金币+1, 只能说一般是 2012-04-28 11:50:18
fannyzehong: 金币+1 2012-04-28 17:14:51
质粒酶切前比酶切后跑的要慢，这个不正确的 ，一般都是环状比线性的要快，，lz可做了菌液pcr？是阳性吗？
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水遁
8楼2012-04-28 10:35:10
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世外清风

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★
fannyzehong: 金币+1 2012-04-28 17:14:21
引用回帖:
8楼: Originally posted by tyw2623 at 2012-04-28 10:35:10:
质粒酶切前比酶切后跑的要慢，这个不正确的 ，一般都是环状比线性的要快，，lz可做了菌液pcr？是阳性吗？

也有可能是开环的啊，就跑胶图来看应该是切开了，不论单酶切还是双酶切！
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9楼2012-04-28 10:56:21
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tyw2623

金虫 (小有名气)
★ ★
yqbter: 金币+2, 感谢参与应助 2012-05-19 12:30:13
引用回帖:
9楼: Originally posted by 世外清风 at 2012-04-28 10:56:21:
也有可能是开环的啊，就跑胶图来看应该是切开了，不论单酶切还是双酶切！

如果是开环的话  应该和单酶切位置一样   单酶切不就是开环了  ？再说从菌液提取的质粒  有时候确实有开环的    但肯定也有环状的     如果没有这个质粒有什么用
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水遁
10楼2012-04-28 14:07:26
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