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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 质粒酶切切不动，质粒在宿主中繁衍酶切位点会突变么？
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番薯素人

新虫 (小有名气)

[交流] 质粒酶切切不动，质粒在宿主中繁衍酶切位点会突变么？ 已有5人参与

大家好！我的实验遇到了点困难，在此向大家求助！
我打算用质粒pMG36e做表达，其多克隆位点有HindIII、SacI这两个酶切位点，我就打算用这两个酶切位点。第一采用的双酶切质粒，连接目的片段，转化后发现全部是载体自连。于是我就用这两个没分别酶切了质粒，结果发现HindIII能切开质粒成线性，而SacI则几乎没有效果，不是酶活力低的问题。实验室的SacI是新买的，TAKARA产品，我又用SacI酶切了其他的含有这个酶切位点的质粒，比如pUC19，酶切效果很好，排除了酶的问题。后来我又试了EroRI、NheI酶切质粒，都能切开，基本也排除了质粒提取不纯之类的因素干扰。我不明白为什么单独SacI切不开。之前我师兄师姐们是用过这两个酶切位点在pMG36e上做表达的，有成功的先例。难道是质粒在宿主中传代的次数多了，酶切位点的碱基发生了突变？请问有这种可能吗？
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1楼 2012-05-20 19:40:08
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madengyu

禁虫 (小有名气)
★ ★ ★
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小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-05-21 13:39:22
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2楼2012-05-20 20:54:11
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lwq652

木虫 (正式写手)
甲基化
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一念错，便觉百行皆非，防之当如渡海浮囊，勿容一针之罅漏
3楼2012-05-20 22:50:40
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番薯素人

新虫 (小有名气)
谢谢二位的建议，不过takara的SacI是不受甲基化影响的呀！我现在从实验室原来保存的菌株里从新提取的质粒，能切开了。不过之前的实验还是很诡异。有人建议我去做质粒测序，我觉得好像不太值当的。。。。。
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4楼2012-05-22 18:10:31
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chibang1220

木虫 (著名写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
酶切连接后你的酶切位点附近序列会改变，还有就是扩增过程存在甲基化的可能。原因有很多种可能
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人的差别在于业余时间
5楼2012-05-22 19:01:39
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atlanticwi

金虫 (正式写手)

琴美喜欢发呆 不喜欢发脾气
★
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引用回帖:
2楼: Originally posted by madengyu at 2012-05-20 20:54:11:
跟我前两天做的一样，我是用Not1切的，也是TAKARA的酶。经请教可能是GC甲基化严重所致，请问楼主：你所用的质粒pMG36e是保存在DH5α菌中的吗？要是那样的话，换一下JM系列的感受态重新转化一下，JM系列的感受态不会

我想请教一下：
按NEB的说明书上来看 楼主所用SacI和您所用的NotI均对Dam Dcm 以及CpG三种甲基化方式是不敏感的 虽然NEB并没有说此说明是绝对性的 但是我想应该不是甲基化的原因 所以想知道您的结果是最后换了JM系列而改善了吗？
还请赐教 我很好奇
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Let God do with it as He wills
6楼2012-05-22 21:29:14
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madengyu

禁虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
本帖内容被屏蔽
7楼2012-05-23 12:48:59
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atlanticwi

金虫 (正式写手)

琴美喜欢发呆 不喜欢发脾气
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引用回帖:
7楼: Originally posted by madengyu at 2012-05-23 12:48:59:
是JM110感受态。我从DH5α提的质粒切不开，但从JM109中提的质粒能切开。而Not1是易受GC甲基化影响的，所以有专家建议采用JM110感受态，把质粒转化进去，再提质粒酶切试试。我这几天找了找JM110感受态，在北京太难找

嘿嘿 不敢不敢
       我对这方面不是很懂 想请教一下 昨天眼拙 没有仔细看到NotI确实被高等真核生物DNA的某系组织特异以及时序调控下的甲基化(CpG形式)完全阻断 这样的话正如您所说 应该换不同株系
       但DH5a和JM110系列的关于甲基化的差距是在 DH5a是Dam/Dcm株系而JM110是dam-/dcm-株系 而NotI有对这两种甲基化方式则完全不敏感
       所以我想可能在于两个株系有对外源DNA的去甲基化方式有差异 但我在两者的基因型上不知道是哪个基因有这方面的作用
       还是我把某些概念搞混了 不是做这个的 很不懂但很感兴趣 希望能高手赐教
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Let God do with it as He wills
8楼2012-05-23 13:25:24
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意孤城_

金虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
酶切位点甲基化了，建议从新够载体，转化的时候使用特殊的去甲基化感受态细胞会避免这种情况
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9楼2013-05-03 16:20:10
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