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质粒酶切切不动，质粒在宿主中繁衍酶切位点会突变么？ 已有5人参与
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大家好！我的实验遇到了点困难，在此向大家求助！ 我打算用质粒pMG36e做表达，其多克隆位点有HindIII、SacI这两个酶切位点，我就打算用这两个酶切位点。第一采用的双酶切质粒，连接目的片段，转化后发现全部是载体自连。于是我就用这两个没分别酶切了质粒，结果发现HindIII能切开质粒成线性，而SacI则几乎没有效果，不是酶活力低的问题。实验室的SacI是新买的，TAKARA产品，我又用SacI酶切了其他的含有这个酶切位点的质粒，比如pUC19，酶切效果很好，排除了酶的问题。后来我又试了EroRI、NheI酶切质粒，都能切开，基本也排除了质粒提取不纯之类的因素干扰。我不明白为什么单独SacI切不开。之前我师兄师姐们是用过这两个酶切位点在pMG36e上做表达的，有成功的先例。难道是质粒在宿主中传代的次数多了，酶切位点的碱基发生了突变？请问有这种可能吗？ |
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2楼2012-05-20 20:54:11
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chibang1220
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7楼2012-05-23 12:48:59
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嘿嘿 不敢不敢 我对这方面不是很懂 想请教一下 昨天眼拙 没有仔细看到NotI确实被高等真核生物DNA的某系组织特异以及时序调控下的甲基化(CpG形式)完全阻断 这样的话正如您所说 应该换不同株系 但DH5a和JM110系列的关于甲基化的差距是在 DH5a是Dam/Dcm株系而JM110是dam-/dcm-株系 而NotI有对这两种甲基化方式则完全不敏感 所以我想可能在于两个株系有对外源DNA的去甲基化方式有差异 但我在两者的基因型上不知道是哪个基因有这方面的作用 还是我把某些概念搞混了 不是做这个的 很不懂但很感兴趣 希望能高手赐教  |
8楼2012-05-23 13:25:24
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