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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 质粒酶切切不动，质粒在宿主中繁衍酶切位点会突变么？
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番薯素人

新虫 (小有名气)

[交流] 质粒酶切切不动，质粒在宿主中繁衍酶切位点会突变么？ 已有5人参与

大家好！我的实验遇到了点困难，在此向大家求助！
我打算用质粒pMG36e做表达，其多克隆位点有HindIII、SacI这两个酶切位点，我就打算用这两个酶切位点。第一采用的双酶切质粒，连接目的片段，转化后发现全部是载体自连。于是我就用这两个没分别酶切了质粒，结果发现HindIII能切开质粒成线性，而SacI则几乎没有效果，不是酶活力低的问题。实验室的SacI是新买的，TAKARA产品，我又用SacI酶切了其他的含有这个酶切位点的质粒，比如pUC19，酶切效果很好，排除了酶的问题。后来我又试了EroRI、NheI酶切质粒，都能切开，基本也排除了质粒提取不纯之类的因素干扰。我不明白为什么单独SacI切不开。之前我师兄师姐们是用过这两个酶切位点在pMG36e上做表达的，有成功的先例。难道是质粒在宿主中传代的次数多了，酶切位点的碱基发生了突变？请问有这种可能吗？
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1楼 2012-05-20 19:40:08
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madengyu

禁虫 (小有名气)
★
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7楼2012-05-23 12:48:59
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madengyu

禁虫 (小有名气)
★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-05-21 13:39:22
本帖内容被屏蔽
2楼2012-05-20 20:54:11
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番薯素人

新虫 (小有名气)
谢谢二位的建议，不过takara的SacI是不受甲基化影响的呀！我现在从实验室原来保存的菌株里从新提取的质粒，能切开了。不过之前的实验还是很诡异。有人建议我去做质粒测序，我觉得好像不太值当的。。。。。
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4楼2012-05-22 18:10:31
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chibang1220

木虫 (著名写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
酶切连接后你的酶切位点附近序列会改变，还有就是扩增过程存在甲基化的可能。原因有很多种可能
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人的差别在于业余时间
5楼2012-05-22 19:01:39
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