应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 质粒酶切切不动，质粒在宿主中繁衍酶切位点会突变么？
51/1返回列表
查看: 2679  |  回复: 8
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

番薯素人

新虫 (小有名气)

[交流] 质粒酶切切不动，质粒在宿主中繁衍酶切位点会突变么？ 已有5人参与

大家好！我的实验遇到了点困难，在此向大家求助！
我打算用质粒pMG36e做表达，其多克隆位点有HindIII、SacI这两个酶切位点，我就打算用这两个酶切位点。第一采用的双酶切质粒，连接目的片段，转化后发现全部是载体自连。于是我就用这两个没分别酶切了质粒，结果发现HindIII能切开质粒成线性，而SacI则几乎没有效果，不是酶活力低的问题。实验室的SacI是新买的，TAKARA产品，我又用SacI酶切了其他的含有这个酶切位点的质粒，比如pUC19，酶切效果很好，排除了酶的问题。后来我又试了EroRI、NheI酶切质粒，都能切开，基本也排除了质粒提取不纯之类的因素干扰。我不明白为什么单独SacI切不开。之前我师兄师姐们是用过这两个酶切位点在pMG36e上做表达的，有成功的先例。难道是质粒在宿主中传代的次数多了，酶切位点的碱基发生了突变？请问有这种可能吗？
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2012-05-20 19:40:08
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

atlanticwi

金虫 (正式写手)

琴美喜欢发呆 不喜欢发脾气
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
2楼: Originally posted by madengyu at 2012-05-20 20:54:11:
跟我前两天做的一样，我是用Not1切的，也是TAKARA的酶。经请教可能是GC甲基化严重所致，请问楼主：你所用的质粒pMG36e是保存在DH5α菌中的吗？要是那样的话，换一下JM系列的感受态重新转化一下，JM系列的感受态不会

我想请教一下：
按NEB的说明书上来看 楼主所用SacI和您所用的NotI均对Dam Dcm 以及CpG三种甲基化方式是不敏感的 虽然NEB并没有说此说明是绝对性的 但是我想应该不是甲基化的原因 所以想知道您的结果是最后换了JM系列而改善了吗？
还请赐教 我很好奇
赞一下 回复此楼
Let God do with it as He wills
6楼2012-05-22 21:29:14
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 9 个回答

madengyu

禁虫 (小有名气)
★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-05-21 13:39:22
本帖内容被屏蔽
2楼2012-05-20 20:54:11
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

番薯素人

新虫 (小有名气)
谢谢二位的建议，不过takara的SacI是不受甲基化影响的呀！我现在从实验室原来保存的菌株里从新提取的质粒，能切开了。不过之前的实验还是很诡异。有人建议我去做质粒测序，我觉得好像不太值当的。。。。。
赞一下 回复此楼
4楼2012-05-22 18:10:31
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

chibang1220

木虫 (著名写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
酶切连接后你的酶切位点附近序列会改变，还有就是扩增过程存在甲基化的可能。原因有很多种可能
赞一下(1人) 回复此楼
人的差别在于业余时间
5楼2012-05-22 19:01:39
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 9 个回答
普通表情 龙 兔 虎 猫 高级回复 (可上传附件)
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[教师之家] 售SCI一区T0P文章，我:8.O55.1.O.54,科目全,可十急 +3 j5mmowWXNWxv 2026-09-05 3/150 2026-09-06 13:09 by eObJPa4gWmp6
[基金申请] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.5.4,科目全,可+急 +3 j5mmowWXNWxv 2026-09-05 3/150 2026-09-06 12:49 by eObJPa4gWmp6
[找工作] 售一区SCI文章T0P，我:8O.551.O54,科目全,可十急 +3 jPDp0sc2B7zQ 2026-09-05 7/350 2026-09-06 11:40 by eObJPa4gWmp6
[基金申请] 科研人应该花精力去思考如何解决问题，而不是去凝练问题 +10 瞬息宇宙 2026-09-01 19/950 2026-09-06 11:15 by jiangxuan2004
[博后之家] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.5.4,科目全,可+急 +3 jPDp0sc2B7zQ 2026-09-05 8/400 2026-09-06 11:09 by eObJPa4gWmp6
[教师之家] 售一区SCI文章T0P，我:8O.551.O54,科目全,可十急 +3 jPDp0sc2B7zQ 2026-09-05 8/400 2026-09-06 11:00 by eObJPa4gWmp6
[考研] 售SCI文章，我:8O.5.5.1O.54,科目全,可十急 +3 jPDp0sc2B7zQ 2026-09-04 7/350 2026-09-06 11:00 by eObJPa4gWmp6
[论文投稿] 售SCI-T0P文章，我:8O.5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +3 jPDp0sc2B7zQ 2026-09-04 8/400 2026-09-06 11:00 by eObJPa4gWmp6
[考研] 售SCI文章，我:8O5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +3 jPDp0sc2B7zQ 2026-09-05 4/200 2026-09-06 07:20 by E1iiBLMU2XnD
[论文投稿] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O54,科目全,可伽急 +6 7ZYIEW2YWn72 2026-09-04 9/450 2026-09-06 06:00 by E1iiBLMU2XnD
[教师之家] 售SCI一区T0P文章，我:8O.55.1.O.54,科目全,可伽急 +8 CRJ0Aq2FtVH0 2026-09-03 15/750 2026-09-06 05:48 by E1iiBLMU2XnD
[论文投稿] 售SCI文章，我:8O5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +3 jPDp0sc2B7zQ 2026-09-05 5/250 2026-09-06 02:19 by E1iiBLMU2XnD
[基金申请] 面上没中，邀请各位路过的虫友分析一下分数 +12 jackleilei 2026-09-03 13/650 2026-09-05 18:10 by fireguard
[文学芳草园] 两块石头 +6 阿美_Lml888 2026-09-03 8/400 2026-09-05 13:52 by 阿美_Lml888
[文学芳草园] 初秋的晨风 +4 阿美_Lml888 2026-09-04 6/300 2026-09-05 13:51 by 阿美_Lml888
[基金申请] 学科评审组评审是指会评吗？ +6 瞬息宇宙 2026-08-31 9/450 2026-09-05 13:11 by haizai99
[博后之家] 广西大学-广州大学招聘博士后 欢迎广大优秀人才！！！ +4 SCSIOyxguo 2026-09-03 7/350 2026-09-05 10:39 by Honglianlian
[硕博家园] Ei源刊怎么投 +4 Fengshun9711 2026-09-04 4/200 2026-09-04 19:30 by 研途知予
[硕博家园] 哈尔滨工业大学韩晓军教授课题组招收2027年硕士推免生及博士研究生 +3 灯灯灯灯DDDD 2026-09-03 3/150 2026-09-03 21:22 by 科研皮皮猪
[基金申请] 要骂人了，新模版改版就是要淡化问题凝练这种虚的东西，结果有个评委还在说凝练得不够 +9 瞬息宇宙 2026-08-31 17/850 2026-09-02 14:04 by anjeeshine
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭