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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 单酶切两条带？
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catmihzh

木虫 (小有名气)

虫虫特攻队队长

[求助] 单酶切两条带？

我将一个1600左右的片段连接到4100左右的质粒上，转化后挑了四个克隆，其中两个提质粒用HindIII单酶切居然出现两个条带，用EcoRI和SalI分别单酶切也是完全一样的情况，请问这可能是什么原因？ 酶切电泳图如文件（第1、4泳道是质粒用HindIII单酶切，上面一条带是4100左右，下面一条带是3000左右，第5、8泳道是对应的未酶切的质粒）
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    • 2012-10-24 14:56:11, 3.81 M

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1楼 2012-10-24 14:58:56
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once1015

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
catmihzh: 金币+1, ★有帮助, 好吧 2012-10-24 19:38:56
测个序 又不贵， 而且能直接找到问题。
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2楼2012-10-24 15:51:37
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honjie

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
catmihzh: 金币+1, ★有帮助, 谢谢回复 2012-10-24 19:39:31
小丹木木: 金币+3, 鼓励应助 2012-10-27 16:01:59
原因可能有2个：1、有2个或多个酶切位点，这个你需要根据质粒和你目的片段的序列去分析；2、你看看这几款酶的说明书中，是否是星号活性导致的。
建议：在确保序列无误的情况下，换支酶，在PCR仪器上切。
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3楼2012-10-24 16:37:00
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zhwenxing

木虫 (著名写手)

尛森蟲

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
catmihzh: 金币+1, ★有帮助, 谢谢回复 2012-10-24 19:43:26
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2012-10-27 16:02:09
1、还在下载图像的过程中，先推测一下：可能接头产生相应的酶切位点了；将你的片段与插入序列连接后用软件分析一下，看看是否有2个切点；
2、图像仍在下载中（楼主，以后为了大家帮忙能够尽快看到结果，请把图像处理好，保持几十k就行了，图像一点点就可以）。
3、 1/4单酶切，两条相加超过7k，你的是5.7k，不对头。2/3是啥？？与1/4的上头的一样大。（切开的非目的重组片段？）
4、 请修改问题，将酶切体系用量、时间等写清楚，每个泳道是啥？说清楚大家才能帮你找原因哈。
5、 手持相机拍照可在前面加一块550-580nm带通滤光片。
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4楼2012-10-24 16:45:47
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爱乐乐
5楼2012-10-24 16:56:55
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catmihzh

木虫 (小有名气)

虫虫特攻队队长
引用回帖:
4楼: Originally posted by zhwenxing at 2012-10-24 16:45:47
1、还在下载图像的过程中，先推测一下：可能接头产生相应的酶切位点了；将你的片段与插入序列连接后用软件分析一下，看看是否有2个切点；
2、图像仍在下载中（楼主，以后为了大家帮忙能够尽快看到结果，请把图像处 ...

2、3泳道是明显没连上片段的质粒，所以我就没说明。体系应该没问题，我之前都用这个体系，时间3-4小时。本来是有凝胶成像系统的，最近坏了，还没修好。
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[url=http://weibo.com/2152924384?s=6uyXnP][img]http://service.t.sina.com.cn/widget/qmd/2152924384/13d43368/7.png[/img][/url]
6楼2012-10-24 19:43:01
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sketch

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+1, 鼓励交流 2012-10-27 16:02:20
可能是酶切不完全 ，3000左右的可能是没有切开的双链质粒，跑得比较快。其实两条带是比较正常的，
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7楼2012-10-27 14:50:13
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