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catmihzh

木虫 (小有名气)

虫虫特攻队队长

[求助] 单酶切两条带?

我将一个1600左右的片段连接到4100左右的质粒上,转化后挑了四个克隆,其中两个提质粒用HindIII单酶切居然出现两个条带,用EcoRI和SalI分别单酶切也是完全一样的情况,请问这可能是什么原因? 酶切电泳图如文件(第1、4泳道是质粒用HindIII单酶切,上面一条带是4100左右,下面一条带是3000左右,第5、8泳道是对应的未酶切的质粒)
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  • 2012-10-24 14:56:11, 3.81 M

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once1015

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
catmihzh: 金币+1, 有帮助, 好吧 2012-10-24 19:38:56
测个序 又不贵, 而且能直接找到问题。
2楼2012-10-24 15:51:37
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honjie

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
catmihzh: 金币+1, 有帮助, 谢谢回复 2012-10-24 19:39:31
小丹木木: 金币+3, 鼓励应助 2012-10-27 16:01:59
原因可能有2个:1、有2个或多个酶切位点,这个你需要根据质粒和你目的片段的序列去分析;2、你看看这几款酶的说明书中,是否是星号活性导致的。
建议:在确保序列无误的情况下,换支酶,在PCR仪器上切。
3楼2012-10-24 16:37:00
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zhwenxing

木虫 (著名写手)

尛森蟲

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
catmihzh: 金币+1, 有帮助, 谢谢回复 2012-10-24 19:43:26
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2012-10-27 16:02:09
1、还在下载图像的过程中,先推测一下:可能接头产生相应的酶切位点了;将你的片段与插入序列连接后用软件分析一下,看看是否有2个切点;
2、图像仍在下载中(楼主,以后为了大家帮忙能够尽快看到结果,请把图像处理好,保持几十k就行了,图像一点点就可以)。
3、 1/4单酶切,两条相加超过7k,你的是5.7k,不对头。2/3是啥??与1/4的上头的一样大。(切开的非目的重组片段?)
4、 请修改问题,将酶切体系用量、时间等写清楚,每个泳道是啥?说清楚大家才能帮你找原因哈。
5、 手持相机拍照可在前面加一块550-580nm带通滤光片。
4楼2012-10-24 16:45:47
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5楼2012-10-24 16:56:55
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catmihzh

木虫 (小有名气)

虫虫特攻队队长

引用回帖:
4楼: Originally posted by zhwenxing at 2012-10-24 16:45:47
1、还在下载图像的过程中,先推测一下:可能接头产生相应的酶切位点了;将你的片段与插入序列连接后用软件分析一下,看看是否有2个切点;
2、图像仍在下载中(楼主,以后为了大家帮忙能够尽快看到结果,请把图像处 ...

2、3泳道是明显没连上片段的质粒,所以我就没说明。体系应该没问题,我之前都用这个体系,时间3-4小时。本来是有凝胶成像系统的,最近坏了,还没修好。
[url=http://weibo.com/2152924384?s=6uyXnP][img]http://service.t.sina.com.cn/widget/qmd/2152924384/13d43368/7.png[/img][/url]
6楼2012-10-24 19:43:01
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sketch

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
小丹木木: 金币+1, 鼓励交流 2012-10-27 16:02:20
可能是酶切不完全 ,3000左右的可能是没有切开的双链质粒,跑得比较快。其实两条带是比较正常的,
7楼2012-10-27 14:50:13
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