应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » pET31b双酶切为何只有一条带呀？？？
121/2返回列表12下一页
查看: 3051  |  回复: 11
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

cdmmore

铜虫 (小有名气)

[求助] pET31b双酶切为何只有一条带呀？？？

各位大侠好，最近我用pET31b空质粒做Nde1和Xho1双酶切，两酶之间大约有380 bp，但为何双酶切后看不到380 bp的条带呢？？两种酶没有问题，已经验证过单酶切都能切开，双酶切也能切开，大小是对的，但就是没有切下来的小片段，这是为何呀？？？
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2012-12-29 22:02:40
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

imyting

至尊木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
cdmmore: 金币+2, ★★★很有帮助, 谢谢，学习了 2012-12-30 13:07:47
其实应该是你没看见，条带亮度都是和质量成正比的，你切下来的380bp片度与你的质粒摩尔量是一样的，那么你能期待它有多亮啊（估计只有你质粒亮度的十几分之一）？我觉得仔细看还是有的，不过用成像系统估计是看不见的。做分子的眼睛都是练出来的，特别是一些先双酶切再胶回收的，经常看不清！
赞一下(1人) 回复此楼
悠哉游哉做实验，成兮败兮我随便
3楼2012-12-30 02:13:05
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
普通回帖

ccharlien

木虫 (正式写手)
你已经验证了双酶切大小是对的（小了380bp）但是看不到380bp的条带？
我猜测可能质粒浓度低片段小有可能胶成像系统的自动设置看不出来或者酶切时间太长了
赞一下 回复此楼
2楼2012-12-29 22:44:34
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
cdmmore: 金币+2, ★有帮助, 谢谢 2012-12-30 13:09:30
缩短电泳时间，加大上样量应该可以看到吧。分子量小的片段亮度本身就比载体暗很多，电泳时间长一点后下面胶的EB浓度变小，更加不容易看清。
赞一下 回复此楼
4楼2012-12-30 02:21:54
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

snoopyzxx

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
cdmmore: 金币+1, ★有帮助, 谢谢，可以试一下重新提质粒 2012-12-30 13:13:55
可以重新提取质粒再切一下试试。
我就遇到过，全合成的序列，直接拿合成公司给的质粒酶切，就是切不下来目的片段，后来用给的菌重提质粒，一下子就出来了。
原因应该是质粒浓度太低。
赞一下 回复此楼
VX：19192310212；公众号：生物技术与IVD
5楼2012-12-30 10:57:38
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

snoopyzxx

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
cdmmore: 金币+2, ★★★很有帮助, 谢谢，这个建议很好，非常感谢！ 2012-12-30 13:19:47
还有一种可能就是你的目的基因没有连接进载体，就是说仅仅是空载体，所以即使是单酶切还是双酶切，都能切开。
目的片段与载体连接后，建议同时做空载体连接对照。如果空连对照长得很少，说明目的基因正确连接的可能性就大。
如果没做空连对照，建议先做一下菌液PCR，能扩出来目的基因的那个克隆，再提质粒酶切鉴定、测序鉴定。
或者，你不想做PCR，你可以同时多挑取几个克隆，提质粒酶切鉴定。
总之，鉴定的方法很多。
赞一下 回复此楼
VX：19192310212；公众号：生物技术与IVD
6楼2012-12-30 11:12:23
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

cdmmore

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by ccharlien at 2012-12-29 22:44:34
你已经验证了双酶切大小是对的（小了380bp）但是看不到380bp的条带？
我猜测可能质粒浓度低片段小有可能胶成像系统的自动设置看不出来或者酶切时间太长了

酶切时间1小时，算长吗？
赞一下 回复此楼
7楼2012-12-30 13:04:42
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

snoopyzxx

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
7楼: Originally posted by cdmmore at 2012-12-30 13:04:42
酶切时间1小时，算长吗？...

看你用什么酶，如果快切酶，说明书说的是5分钟就够了。
普通的酶，我一般是37度3小时。
赞一下 回复此楼
VX：19192310212；公众号：生物技术与IVD
8楼2012-12-30 13:10:43
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

cdmmore

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-12-30 02:21:54
缩短电泳时间，加大上样量应该可以看到吧。分子量小的片段亮度本身就比载体暗很多，电泳时间长一点后下面胶的EB浓度变小，更加不容易看清。

上样量20 ul还是看不到。
另外，请教一下为什么电泳时间长EB浓度变小呢？EB是加在胶里面的
赞一下 回复此楼
9楼2012-12-30 13:12:13
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

cdmmore

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by snoopyzxx at 2012-12-30 13:10:43
看你用什么酶，如果快切酶，说明书说的是5分钟就够了。
普通的酶，我一般是37度3小时。...

用的是Takara的普通的酶
赞一下 回复此楼
10楼2012-12-30 13:21:20
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 cdmmore 的主题更新
121/2返回列表12下一页
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[基金申请] 听说今天filecode变了 +16 布布和一二 2026-08-06 30/1500 2026-08-06 21:37 by 虫友是什么虫
[基金申请] filecode +10 等待解的谜 2026-08-06 14/700 2026-08-06 21:16 by zhanghaozhu
[基金申请] 固定端突然变了，今天 +3 archvillain 2026-08-06 7/350 2026-08-06 21:05 by archvillain
[基金申请] filecode +8 布布和一二 2026-08-06 11/550 2026-08-06 20:41 by tangpu318
[基金申请] 大家散了吧，后缀研究没有意义，别浪费时间了，过好目前的每一天，不要焦虑 +5 Tide man 2026-08-06 6/300 2026-08-06 20:19 by 苏知砚
[基金申请] 基金中了 +4 laoda193707 2026-08-06 4/200 2026-08-06 18:56 by olivermiaoer
[有机交流] 一个有机合成实验室都需要哪些设备？ 50+3 kf2781974 2026-07-31 12/600 2026-08-06 15:11 by eddyin
[基金申请] 求各位大神看下 100+6 hpkpkpkp 2026-08-05 33/1650 2026-08-06 14:49 by zhiyanjiang
[教师之家] 咨询面上基金 +4 李长云 2026-07-31 7/350 2026-08-06 11:20 by 李长云
[基金申请] 影响面上的因素 +8 布布和一二 2026-08-05 11/550 2026-08-06 10:41 by 宝贝虫子
[基金申请] 8月时间戳变的，举个手。玩一下，释放压力 +9 archvillain 2026-08-04 11/550 2026-08-05 20:06 by wlwhappy
[基金申请] 面上再次挂了，太难了，躺也躺不了，倦也卷不过，小学校之殇！ +22 低垂的野花 2026-07-31 30/1500 2026-08-05 18:03 by 低垂的野花
[基金申请] 好消息？这个有何含义？？？ +8 Tide man 2026-08-05 10/500 2026-08-05 16:14 by xmuxiaoyu
[考博] 【2027博士申请】纳米药物递送方向 20+3 13586093586 2026-08-03 4/200 2026-08-05 09:59 by lfy8008
[基金申请] 有没有H口的？有收到消息的吗？ +3 超级海虾 2026-08-04 3/150 2026-08-04 17:26 by 学教育滴
[论文投稿] 十年后又回来了，论文投稿求助 +3 哈哈114477 2026-08-01 3/150 2026-08-04 15:40 by tegsgjy20
[基金申请] 纯娱乐，不喜欢勿喷 +7 Tide man 2026-08-04 10/500 2026-08-04 15:10 by loufangrui
[基金申请] 面上提前没消息，有中的吗 +14 archvillain 2026-08-02 18/900 2026-08-04 14:42 by archvillain
[基金申请] 娱乐 +4 Tide man 2026-08-03 4/200 2026-08-04 11:51 by wgch518
[基金申请] 什么时候能放榜呀？ +3 Jacob678 2026-08-03 3/150 2026-08-03 16:14 by gltch
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭