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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » pET31b双酶切为何只有一条带呀？？？
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cdmmore

铜虫 (小有名气)

[求助] pET31b双酶切为何只有一条带呀？？？

各位大侠好，最近我用pET31b空质粒做Nde1和Xho1双酶切，两酶之间大约有380 bp，但为何双酶切后看不到380 bp的条带呢？？两种酶没有问题，已经验证过单酶切都能切开，双酶切也能切开，大小是对的，但就是没有切下来的小片段，这是为何呀？？？
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1楼 2012-12-29 22:02:40
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

imyting

至尊木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
cdmmore: 金币+2, ★★★很有帮助, 谢谢，学习了 2012-12-30 13:07:47
其实应该是你没看见，条带亮度都是和质量成正比的，你切下来的380bp片度与你的质粒摩尔量是一样的，那么你能期待它有多亮啊（估计只有你质粒亮度的十几分之一）？我觉得仔细看还是有的，不过用成像系统估计是看不见的。做分子的眼睛都是练出来的，特别是一些先双酶切再胶回收的，经常看不清！
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悠哉游哉做实验，成兮败兮我随便
3楼2012-12-30 02:13:05
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普通回帖

ccharlien

木虫 (正式写手)
你已经验证了双酶切大小是对的（小了380bp）但是看不到380bp的条带？
我猜测可能质粒浓度低片段小有可能胶成像系统的自动设置看不出来或者酶切时间太长了
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2楼2012-12-29 22:44:34
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
cdmmore: 金币+2, ★有帮助, 谢谢 2012-12-30 13:09:30
缩短电泳时间，加大上样量应该可以看到吧。分子量小的片段亮度本身就比载体暗很多，电泳时间长一点后下面胶的EB浓度变小，更加不容易看清。
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4楼2012-12-30 02:21:54
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snoopyzxx

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
cdmmore: 金币+1, ★有帮助, 谢谢，可以试一下重新提质粒 2012-12-30 13:13:55
可以重新提取质粒再切一下试试。
我就遇到过，全合成的序列，直接拿合成公司给的质粒酶切，就是切不下来目的片段，后来用给的菌重提质粒，一下子就出来了。
原因应该是质粒浓度太低。
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VX：19192310212；公众号：生物技术与IVD
5楼2012-12-30 10:57:38
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snoopyzxx

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
cdmmore: 金币+2, ★★★很有帮助, 谢谢，这个建议很好，非常感谢！ 2012-12-30 13:19:47
还有一种可能就是你的目的基因没有连接进载体，就是说仅仅是空载体，所以即使是单酶切还是双酶切，都能切开。
目的片段与载体连接后，建议同时做空载体连接对照。如果空连对照长得很少，说明目的基因正确连接的可能性就大。
如果没做空连对照，建议先做一下菌液PCR，能扩出来目的基因的那个克隆，再提质粒酶切鉴定、测序鉴定。
或者，你不想做PCR，你可以同时多挑取几个克隆，提质粒酶切鉴定。
总之，鉴定的方法很多。
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VX：19192310212；公众号：生物技术与IVD
6楼2012-12-30 11:12:23
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cdmmore

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by ccharlien at 2012-12-29 22:44:34
你已经验证了双酶切大小是对的（小了380bp）但是看不到380bp的条带？
我猜测可能质粒浓度低片段小有可能胶成像系统的自动设置看不出来或者酶切时间太长了

酶切时间1小时，算长吗？
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7楼2012-12-30 13:04:42
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snoopyzxx

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
7楼: Originally posted by cdmmore at 2012-12-30 13:04:42
酶切时间1小时，算长吗？...

看你用什么酶，如果快切酶，说明书说的是5分钟就够了。
普通的酶，我一般是37度3小时。
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VX：19192310212；公众号：生物技术与IVD
8楼2012-12-30 13:10:43
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cdmmore

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-12-30 02:21:54
缩短电泳时间，加大上样量应该可以看到吧。分子量小的片段亮度本身就比载体暗很多，电泳时间长一点后下面胶的EB浓度变小，更加不容易看清。

上样量20 ul还是看不到。
另外，请教一下为什么电泳时间长EB浓度变小呢？EB是加在胶里面的
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9楼2012-12-30 13:12:13
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cdmmore

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by snoopyzxx at 2012-12-30 13:10:43
看你用什么酶，如果快切酶，说明书说的是5分钟就够了。
普通的酶，我一般是37度3小时。...

用的是Takara的普通的酶
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10楼2012-12-30 13:21:20
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