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yu棒棒

新虫 (初入文坛)

[求助] PET-30a 双酶切

本人最近在做PET-30a的ECOR I 和NOT I的双酶切，可是做了好多次都没有成功，酶切后跑电泳仍是一条带，不知道是什么问题出了错，请高手指点下。
酶切体系如下： 5ul 质粒
                          1ul 10*H
                          1ul BSA
                          0.5ul ECOR I
                          0.5ul NOT I
                          2ul  H2O
酶切条件尝试过37度两小时，37度三小时，还尝试过37度过夜。
现在实验无法继续，跪求前辈指点，谢谢！
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1楼 2012-10-30 14:43:22
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zhwenxing

木虫 (著名写手)

尛森蟲

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+5, 鼓励积极应助 2012-10-30 16:04:09
yu棒棒: 金币+8, ★★★★★最佳答案 2012-10-30 22:24:46
1、双酶切，一般做：酶1单切，酶2单切，双酶切，不酶切，跑胶时候能够对照，甚至用另外一种常用的酶X单酶切，若X在插入片段有切点，而在载体上没有切点，就能知道你连接进去啦；
2、不知楼主采用的是什么牌子的RE？是TaKaRa的吗？Fermentas的快速酶切很好用；不论哪个牌子的，都可以。此常用载体不需要过夜酶切，时间长了还产生星活性呢！
3、 “5 ul”质粒这种说法希望以后就别再出现了，质粒的浓度不一样、大小不一样，mol数量太模糊了！注意不要加入太多的质粒，再就是质粒洗脱时注意用量，去除乙醇等的影响。
4、 可PCR先检测一下插入片段连进去了没有？
5、酶切体系不要扩大，双酶切时候，酶的用量要减少，我一般是0.5-0.7ul足以，常用的这些RE活性了得。

尝试一下吧~吼吼，希望对你有用。
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» 本帖已获得的红花（最新10朵）

yu棒棒
2楼2012-10-30 15:14:03
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yu棒棒

新虫 (初入文坛)
送鲜花一朵
引用回帖:
2楼: Originally posted by zhwenxing at 2012-10-30 15:14:03
1、双酶切，一般做：酶1单切，酶2单切，双酶切，不酶切，跑胶时候能够对照，甚至用另外一种常用的酶X单酶切，若X在插入片段有切点，而在载体上没有切点，就能知道你连接进去啦；
2、不知楼主采用的是什么牌子的RE？ ...

非常感谢您的建议！
我是分子初入门者，很多问题都不是很理解，希望有机会能多跟您学习。
我现在想要做的是把双酶切后的目的基因连接到用RE双酶切的PET-30a上，但我用TaKaRa的RE切PET-30a， 怎么也切不开，所以我还没有进行到连接这一步骤。我电泳的时候一般都是点一个没切过的质粒做对照，结果总是出现一样的条带，我想尝试新的酶试试~
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3楼2012-10-30 22:24:40
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
引用回帖:
3楼: Originally posted by yu棒棒 at 2012-10-30 22:24:40
非常感谢您的建议！
我是分子初入门者，很多问题都不是很理解，希望有机会能多跟您学习。
我现在想要做的是把双酶切后的目的基因连接到用RE双酶切的PET-30a上，但我用TaKaRa的RE切PET-30a， 怎么也切不开，所以我 ...

如果只是切载体，你选的酶切位点是在多克隆位点处，双酶切也只是把载体切成线性分子，当然是一条带了，切下来的那一小段分子量很小，跑胶也看不到的。做双酶切时候要注意确保两个酶都切割比较完全，最好有单酶切的对照。判断是否切开质粒可以跑一个质粒对照。所提的质粒大部分以超螺旋形式存在，跑得比线性分子快。
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4楼2012-10-31 08:16:02
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冰风颤木

金虫 (正式写手)
你这个载体双酶切应该就是一条带啊。。。。
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船到桥头自然直
5楼2013-06-18 22:18:14
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