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PET-30a 双酶切
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本人最近在做PET-30a的ECOR I 和NOT I的双酶切，可是做了好多次都没有成功，酶切后跑电泳仍是一条带，不知道是什么问题出了错，请高手指点下。 酶切体系如下： 5ul 质粒 1ul 10*H 1ul BSA 0.5ul ECOR I 0.5ul NOT I 2ul H2O 酶切条件尝试过37度两小时，37度三小时，还尝试过37度过夜。 现在实验无法继续，跪求前辈指点，谢谢！ |
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zhwenxing
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小丹木木: 金币+5, 鼓励积极应助 2012-10-30 16:04:09
yu棒棒: 金币+8, ★★★★★最佳答案 2012-10-30 22:24:46
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1、双酶切，一般做：酶1单切，酶2单切，双酶切，不酶切，跑胶时候能够对照，甚至用另外一种常用的酶X单酶切，若X在插入片段有切点，而在载体上没有切点，就能知道你连接进去啦； 2、不知楼主采用的是什么牌子的RE？是TaKaRa的吗？Fermentas的快速酶切很好用；不论哪个牌子的，都可以。此常用载体不需要过夜酶切，时间长了还产生星活性呢！ 3、 “5 ul”质粒这种说法希望以后就别再出现了，质粒的浓度不一样、大小不一样，mol数量太模糊了！注意不要加入太多的质粒，再就是质粒洗脱时注意用量，去除乙醇等的影响。 4、 可PCR先检测一下插入片段连进去了没有？ 5、酶切体系不要扩大，双酶切时候，酶的用量要减少，我一般是0.5-0.7ul足以，常用的这些RE活性了得。 尝试一下吧~吼吼，希望对你有用。 |
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yu棒棒2楼2012-10-30 15:14:03
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cicelyzh
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