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双酶切连TA后切不开
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各位大侠，这里看~~~ 一、我的目的片段已经与pMD-18Tsimple vector连接上之后，挑菌落pcr有目的条带呈阳性。 二、然后提质粒之后做双酶切。可是却切不开。用的是EcoR l 和Sal l两种酶，我做的是20ul体系，反应3h，37°c，水浴。 三、电泳结果，与未酶切的质粒条带做对比，条带跑到后面，EcoR l 单酶切了，但是Sal l与没有酶切组相同。 我考虑的问题： 因为我的pcr引物自加上了这两种酶切位点，但是当时没有考虑到保护碱基的特异性，都只是在酶切位点后加了一个A。是不是这个引物设计的时候出现问题了？ PS：酶活应该是没有问题的，因为用来切过实验室的其他载体，能切开的。 现在想要扩增这个片段，然后插入表达载体，但是一直切不开，很痛苦，做了一个多月了。大家请帮帮忙，八仙过海各显神通~~~本人不胜感激~！ |
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