应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

CyRhmU.jpeg
小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 双酶切连TA后切不开
61/1返回列表
查看: 2032  |  回复: 13
查看全部回帖@他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

emma立夏

铁虫 (初入文坛)

[求助] 双酶切连TA后切不开

各位大侠，这里看~~~
一、我的目的片段已经与pMD-18Tsimple vector连接上之后，挑菌落pcr有目的条带呈阳性。
二、然后提质粒之后做双酶切。可是却切不开。用的是EcoR l 和Sal l两种酶，我做的是20ul体系，反应3h，37°c，水浴。
三、电泳结果，与未酶切的质粒条带做对比，条带跑到后面，EcoR l 单酶切了，但是Sal l与没有酶切组相同。
我考虑的问题：
因为我的pcr引物自加上了这两种酶切位点，但是当时没有考虑到保护碱基的特异性，都只是在酶切位点后加了一个A。是不是这个引物设计的时候出现问题了？
PS：酶活应该是没有问题的，因为用来切过实验室的其他载体，能切开的。
现在想要扩增这个片段，然后插入表达载体，但是一直切不开，很痛苦，做了一个多月了。大家请帮帮忙，八仙过海各显神通~~~本人不胜感激~！
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼2012-04-30 23:39:59
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

emma立夏

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by nemo88 at 2012-05-01 11:43:53:
虽然不是太懂不过我想说下我的想法…
一是我觉着保护碱基在克隆到t载体后作用还会明显么…我一直理解保护碱基是直接酶切pcr产物时才需要考虑的，而且酶切效率跟网上提供的数据有出入，并没有那么绝对…
二是…你测 ...

你好，十分感谢你的回帖，酶确认是没有失效的，因为做过其他的质粒相同位点，可以切开的。没有测序，考虑到要是测序了。但是依旧切不开岂不是浪费了测序的钱~
赞一下 回复此楼
3楼2012-05-01 14:01:12
 已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

emma立夏

铁虫 (初入文坛)
送鲜花一朵
引用回帖:
5楼: Originally posted by 世外清风 at 2012-05-02 08:23:32:
先测序看看吧，这样无谓的重复，不仅是对金钱的浪费，也浪费了最宝贵的时间和意志！PCR的假阳性率很高，不要太相信PCR，关键还是酶切，你可以用T载体上的酶切位点切切看，看是不是连入东西了！祝好运！

谢谢你的意见，但是由于我用的是pMD-18Tsimple vector。没有多克隆位点的。所以我只能用我片段上的酶切位点了。
赞一下 回复此楼
11楼2012-05-07 19:49:37
 已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

emma立夏

铁虫 (初入文坛)
送鲜花一朵
引用回帖:
7楼: Originally posted by post_ngao at 2012-05-02 20:14:59:
这种情况必须果断测序，否则一直盲做更加费钱，还费时费力。时间才是最宝贵的，一切能够用钱解决的问题都不是问题。

对的，大家都是建议测序，我也打算马上测序了，谢谢你的回复。
赞一下 回复此楼
12楼2012-05-07 19:51:17
 已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

emma立夏

铁虫 (初入文坛)
送鲜花一朵
引用回帖:
8楼: Originally posted by huguangdong at 2012-05-03 09:50:41:
你这个问题和保护碱基没关系，连接到T载体酶切效果比加保护碱基要好很多。PCR用的是TAQ酶吧？如果是，就直接做TA克隆，用的是哪个公司的酶？酶切效率也是问题，再就是看看水浴锅温度，用温度计测一下。还有你说你 ...

都是用TAKARA的，pcr mix ，酶也都是用的takara~~~谢谢你的提议~！！
赞一下 回复此楼
13楼2012-05-07 21:08:19
 已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 emma立夏 的主题更新
61/1返回列表
普通表情 龙 兔 虎 猫
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭