应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 双酶切，体系，切不出来
111/2返回列表12下一页
查看: 2638  |  回复: 10
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
本帖产生 1 个 MolEPI ，点击这里进行查看

XI4ZHL

铜虫 (著名写手)

[求助] 双酶切，体系，切不出来

各位虫友，我在构建载体是，用Hind III和sac2进行双酶切，怎么切不出来，怎么设计体系好？怎么做才能做出来啊？ 我是先提质粒和扩出目的片段（加了酶切位点），然后根据说明书双酶切，纯化，连接，转化，涂板，挑菌，最后做了pcr，可是没有目的带！我该怎么弄比较好！！求各位虫友，给我想想办法吧！小弟不胜感激，谢谢！！！说明书中的体系是水16   buffer2  酶分别0.5  dna 1。还有连接反应说是质粒20-100ng DNA是1：1to5:1，我不知道我的浓度，就加了1ul的质粒，5ul的DNA ！
回复此楼

» 收录本帖的淘帖专辑推荐

【分子生物】EPI帖

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
心，是用来使用的，不能搁浅！
1楼 2011-09-26 21:37:56
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

XI4ZHL

铜虫 (著名写手)
我的酶切是在37度过夜，涂板也有菌生长是怎么回事，我用的是peGFP-N1，抗卡那，加了卡那怎么还长菌，是转进去了空质粒吗？？
赞一下 回复此楼
心，是用来使用的，不能搁浅！
2楼2011-09-26 21:57:32
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

yidC423R

银虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
dhd997(金币+3): good 2011-09-27 07:36:03
XI4ZHL(金币+1): 2011-09-28 11:36:13
too many possibilities. How many nucleotides did you put outside the cutting side? how do you make sure the cutting is 100%? have you checked the DNA conc after the PCR & purification? have you set up a neg control for the ligation? you have to know the conc of both fragments for the ligation. there are so many problems in your experiment.
赞一下(2人) 回复此楼
3楼2011-09-26 22:20:51
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

瓶儿花

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
dhd997(金币+5, MolEPI+1): 最近很活跃啊，鼓励加鼓励 2011-09-27 07:36:32
XI4ZHL(金币+2): 2011-09-28 11:36:21
1.要做连接的话，反应体系要扩大到40μL.
质粒 20μL
限制性内切酶 各2μL
Buffer    4μL
双蒸水   补足到40μL
37℃反应2h以上。
2.你的质粒加的太少了，浓度太低。
3.你的目的产物说是有设计酶切位点，那酶切位点有加保护碱基吗？有些酶切位点不加保护碱基，PCR产物直接酶切是切不动的，建议你连到T载体上再酶切。
4.你的实验没有加对照，你的载体酶切，你不能确定酶切是否完全，所以对照是必须的。
对照组：
酶切后的载体  1μL
10×T4 DNA ligase Buffer  1μL
T4 DNA ligase   1μL
双蒸水   up to 10μL
与实验组一起转化涂布抗性平板，看长出来的菌落多少，如果很多的话，说明你酶切不完全，要重新做过。
赞一下(1人) 回复此楼
4楼2011-09-26 23:44:10
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

nach

铜虫 (著名写手)

不让吃就去死
260nm分光测一下浓度 挺容易的
赞一下 回复此楼
不让吃就去死
5楼2011-09-27 00:56:32
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

cdl007

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

建议质粒送去测一下序，主要是酶切位点附近的序列，一看就知道怎么回事了
赞一下 回复此楼
6楼2011-09-27 06:18:39
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

XI4ZHL

铜虫 (著名写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by yidC423R at 2011-09-26 22:20:51:
too many possibilities. How many nucleotides did you put outside the cutting side? how do you make sure the cutting is 100%? have you checked the DNA conc after the PCR & purification? have you ...

这些问题我都没做，我第一次做这个实验，实验室也没做到，你能不能给我详细说说都有哪些步骤啊，谢谢，能用汉语回答吗，看英语有点吃力，谢谢
赞一下 回复此楼
心，是用来使用的，不能搁浅！
7楼2011-09-27 17:38:08
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

XI4ZHL

铜虫 (著名写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 瓶儿花 at 2011-09-26 23:44:10:
1.要做连接的话，反应体系要扩大到40μL.
质粒 20μL
限制性内切酶 各2μL
Buffer    4μL
双蒸水   补足到40μL
37℃反应2h以上。
2.你的质粒加的太少了，浓度太低。
3.你的目的产物说是有设计酶切位点， ...

那我在双酶切时，目的基因是不是也要扩大到40ul，
也是  20ul目的基因
限制性内切酶各 2ul
buffer 4ul
双蒸水到 40ul
也是这样吗？
那做链接时，质粒 和目的基因加多少好啊？
我的没保护碱基，我尽快设上
谢谢
赞一下 回复此楼
心，是用来使用的，不能搁浅！
8楼2011-09-27 17:56:49
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

XI4ZHL

铜虫 (著名写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by cdl007 at 2011-09-27 06:18:39:
建议质粒送去测一下序，主要是酶切位点附近的序列，一看就知道怎么回事了

是没有酶切的质粒送去测序吗？测序的目的是什么啊，质粒的序列我都知道，能详细说说嘛，谢谢
赞一下 回复此楼
心，是用来使用的，不能搁浅！
9楼2011-09-27 17:58:10
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

cdl007

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

XI4ZHL(金币+2): 2011-09-28 11:36:43
没有切出来的质粒测序，

目的是看连接的对不对

不是为了测质粒序列，通常出错都在酶切位点
赞一下 回复此楼
10楼2011-09-27 18:03:09
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 XI4ZHL 的主题更新
111/2返回列表12下一页
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[找工作] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O54,科目全,可伽急 +3 s3fFTmArrBt6 2026-09-14 4/200 2026-09-14 17:48 by Aj1rhIDL5ixY
[考博] 售SCI一区文章，我:8O5.5.1.O5.4,科目全,可伽急 +4 s3fFTmArrBt6 2026-09-14 4/200 2026-09-14 17:25 by Aj1rhIDL5ixY
[教师之家] 售SCI一区文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可伽急 +3 LwdutQ8HoqWP 2026-09-13 4/200 2026-09-14 16:13 by Aj1rhIDL5ixY
[考研] 售SCI文章，我:8O5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +4 LwdutQ8HoqWP 2026-09-13 4/200 2026-09-14 16:12 by Aj1rhIDL5ixY
[找工作] 售SCI一区文章，我:8O5.5.1.O5.4,科目全,可伽急 +4 3n8v2C8RimXI 2026-09-13 4/200 2026-09-14 16:00 by Aj1rhIDL5ixY
[博后之家] 售SCI一区T0P文章，我:8.O55.1.O.54,科目全,可十急 +4 3n8v2C8RimXI 2026-09-13 4/200 2026-09-14 15:57 by Aj1rhIDL5ixY
[教师之家] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可+急 +4 3n8v2C8RimXI 2026-09-13 4/200 2026-09-14 15:48 by Aj1rhIDL5ixY
[考研] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O54,科目全,可伽急 +3 3n8v2C8RimXI 2026-09-13 4/200 2026-09-14 15:45 by Aj1rhIDL5ixY
[考博] 售SCI文章，我:8O.5.5.1O.54,科目全,可十急 +4 3n8v2C8RimXI 2026-09-13 4/200 2026-09-14 15:37 by Aj1rhIDL5ixY
[考博] 售SCI文章，我:8O5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +4 QUjhNVAcOSff 2026-09-13 4/200 2026-09-14 15:13 by Aj1rhIDL5ixY
[硕博家园] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O54,科目全,可伽急 +3 QUjhNVAcOSff 2026-09-13 3/150 2026-09-14 15:09 by Aj1rhIDL5ixY
[博后之家] 售SCI一区T0P文章，我:8O.55.1.O.54,科目全,可伽急 +3 QUjhNVAcOSff 2026-09-13 4/200 2026-09-14 15:01 by Aj1rhIDL5ixY
[公派出国] 售SCI一区T0P文章，我:8.O55.1.O.54,科目全,可十急 +4 QUjhNVAcOSff 2026-09-13 6/300 2026-09-14 15:00 by Aj1rhIDL5ixY
[基金申请] 求教各位大神：2026教育部人文社科青年基金项目何时公示呀？ +5 云宴山人 2026-09-10 7/350 2026-09-14 12:11 by ecnu2013
[考研] 售SCI一区文章，我:8.O.551.O.5.4,科目全,可伽急 +3 QUjhNVAcOSff 2026-09-13 4/200 2026-09-14 10:01 by 23jxep3nCNZb
[考博] 西北工业大学材料学院电化学传感与催化课题组招收2027年推免研究生、博士生、博士后 +3 马方园 2026-09-10 4/200 2026-09-14 09:29 by Chem张zz
[考博] 27秋季材料博士申请求助 10+3 Cahal1 2026-09-11 4/200 2026-09-14 08:50 by 北京莱茵编辑
[教师之家] 浙江师范大学是怎么坑我的 +10 recruit123 2026-09-09 15/750 2026-09-13 10:45 by seaskyy
[基金申请] 面上有专家说实验设备不是我们单位的 +6 zj_muchong 2026-09-08 8/400 2026-09-11 06:56 by suifengdao
[有机交流] 科研求助 10+4 我吃一只鱼 2026-09-07 4/200 2026-09-10 08:32 by 0940628
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭