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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 双酶切，体系，切不出来
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XI4ZHL

铜虫 (著名写手)

[求助] 双酶切，体系，切不出来

各位虫友，我在构建载体是，用Hind III和sac2进行双酶切，怎么切不出来，怎么设计体系好？怎么做才能做出来啊？ 我是先提质粒和扩出目的片段（加了酶切位点），然后根据说明书双酶切，纯化，连接，转化，涂板，挑菌，最后做了pcr，可是没有目的带！我该怎么弄比较好！！求各位虫友，给我想想办法吧！小弟不胜感激，谢谢！！！说明书中的体系是水16   buffer2  酶分别0.5  dna 1。还有连接反应说是质粒20-100ng DNA是1：1to5:1，我不知道我的浓度，就加了1ul的质粒，5ul的DNA ！
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心，是用来使用的，不能搁浅！
1楼 2011-09-26 21:37:56
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XI4ZHL

铜虫 (著名写手)
我的酶切是在37度过夜，涂板也有菌生长是怎么回事，我用的是peGFP-N1，抗卡那，加了卡那怎么还长菌，是转进去了空质粒吗？？
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心，是用来使用的，不能搁浅！
2楼2011-09-26 21:57:32
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yidC423R

银虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
dhd997(金币+3): good 2011-09-27 07:36:03
XI4ZHL(金币+1): 2011-09-28 11:36:13
too many possibilities. How many nucleotides did you put outside the cutting side? how do you make sure the cutting is 100%? have you checked the DNA conc after the PCR & purification? have you set up a neg control for the ligation? you have to know the conc of both fragments for the ligation. there are so many problems in your experiment.
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3楼2011-09-26 22:20:51
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瓶儿花

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
dhd997(金币+5, MolEPI+1): 最近很活跃啊，鼓励加鼓励 2011-09-27 07:36:32
XI4ZHL(金币+2): 2011-09-28 11:36:21
1.要做连接的话，反应体系要扩大到40μL.
质粒 20μL
限制性内切酶 各2μL
Buffer    4μL
双蒸水   补足到40μL
37℃反应2h以上。
2.你的质粒加的太少了，浓度太低。
3.你的目的产物说是有设计酶切位点，那酶切位点有加保护碱基吗？有些酶切位点不加保护碱基，PCR产物直接酶切是切不动的，建议你连到T载体上再酶切。
4.你的实验没有加对照，你的载体酶切，你不能确定酶切是否完全，所以对照是必须的。
对照组：
酶切后的载体  1μL
10×T4 DNA ligase Buffer  1μL
T4 DNA ligase   1μL
双蒸水   up to 10μL
与实验组一起转化涂布抗性平板，看长出来的菌落多少，如果很多的话，说明你酶切不完全，要重新做过。
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4楼2011-09-26 23:44:10
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nach

铜虫 (著名写手)

不让吃就去死
260nm分光测一下浓度 挺容易的
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不让吃就去死
5楼2011-09-27 00:56:32
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cdl007

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

建议质粒送去测一下序，主要是酶切位点附近的序列，一看就知道怎么回事了
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6楼2011-09-27 06:18:39
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XI4ZHL

铜虫 (著名写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by yidC423R at 2011-09-26 22:20:51:
too many possibilities. How many nucleotides did you put outside the cutting side? how do you make sure the cutting is 100%? have you checked the DNA conc after the PCR & purification? have you ...

这些问题我都没做，我第一次做这个实验，实验室也没做到，你能不能给我详细说说都有哪些步骤啊，谢谢，能用汉语回答吗，看英语有点吃力，谢谢
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心，是用来使用的，不能搁浅！
7楼2011-09-27 17:38:08
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XI4ZHL

铜虫 (著名写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 瓶儿花 at 2011-09-26 23:44:10:
1.要做连接的话，反应体系要扩大到40μL.
质粒 20μL
限制性内切酶 各2μL
Buffer    4μL
双蒸水   补足到40μL
37℃反应2h以上。
2.你的质粒加的太少了，浓度太低。
3.你的目的产物说是有设计酶切位点， ...

那我在双酶切时，目的基因是不是也要扩大到40ul，
也是  20ul目的基因
限制性内切酶各 2ul
buffer 4ul
双蒸水到 40ul
也是这样吗？
那做链接时，质粒 和目的基因加多少好啊？
我的没保护碱基，我尽快设上
谢谢
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心，是用来使用的，不能搁浅！
8楼2011-09-27 17:56:49
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XI4ZHL

铜虫 (著名写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by cdl007 at 2011-09-27 06:18:39:
建议质粒送去测一下序，主要是酶切位点附近的序列，一看就知道怎么回事了

是没有酶切的质粒送去测序吗？测序的目的是什么啊，质粒的序列我都知道，能详细说说嘛，谢谢
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心，是用来使用的，不能搁浅！
9楼2011-09-27 17:58:10
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cdl007

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

XI4ZHL(金币+2): 2011-09-28 11:36:43
没有切出来的质粒测序，

目的是看连接的对不对

不是为了测质粒序列，通常出错都在酶切位点
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10楼2011-09-27 18:03:09
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