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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】HindIII,NdeI双酶切体系
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Kimi123

铜虫 (初入文坛)

[交流] 【求助/交流】HindIII,NdeI双酶切体系 已有4人参与

求助各位大仙,HindIII,NdeI切割PET-22b的双酶切体系与酶切时间,小弟做了半个多月了还没切开
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1楼 2010-10-29 11:20:41
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jackiechubut

木虫 (小有名气)
★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
dhd997(金币+1):谢谢交流。 2010-10-29 14:20:54
pet22载体上这两个酶切切出来的小片段只有110bp左右，所以要想看到的话需要足够的质粒量才可以。或者选择的buffer是否有问题。如果是只看到大片段质粒的话，建议跑胶的时候点个质粒做个对照。
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一笑寂寥空万古，三分明月照大江
2楼2010-10-29 14:16:20
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Kimi123

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by jackiechubut at 2010-10-29 14:16:20:
pet22载体上这两个酶切切出来的小片段只有110bp左右，所以要想看到的话需要足够的质粒量才可以。或者选择的buffer是否有问题。如果是只看到大片段质粒的话，建议跑胶的时候点个质粒做个对照。

BUFFER是TAKARA公司推荐的共用BUFFER,应该没有问题,全加质粒的话试过,根本切不开
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3楼2010-10-29 15:11:32
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
你如何判断没切开？
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4楼2010-10-29 15:46:39
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Kimi123

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by 三磷酸腺苷 at 2010-10-29 15:46:39:
你如何判断没切开？

不加目的基因直接酶连转化能长出菌落就是没切开
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5楼2010-10-29 16:11:41
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Kimi123

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by 三磷酸腺苷 at 2010-10-29 15:46:39:
你如何判断没切开？

当然在感受态,Amp抗性都作对照不存在问题的情况下
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6楼2010-10-29 16:14:28
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
dhd997(金币+1):鼓励交流。 2010-10-30 08:46:59
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Originally posted by Kimi123 at 2010-10-29 16:11:41:

不加目的基因直接酶连转化能长出菌落就是没切开

可能情况
1、没有切干净，并不是没有切开
2、切完之后没有回收，导致切开的部分在连接酶存在的情况下又连回去

你切完之后做个胶回收吧
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7楼2010-10-29 16:35:50
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smilerion

银虫 (初入文坛)
★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
dhd997(金币+1):鼓励交流。 2010-10-30 08:47:09
切没切开可以跑胶看的，切下的片段不胶回收，直接连转当然能长斑了，不知到你回收了么，如果片段较小要多切跑胶才能看到回收。
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8楼2010-10-30 01:54:33
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Kimi123

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by smilerion at 2010-10-30 01:54:33:
切没切开可以跑胶看的，切下的片段不胶回收，直接连转当然能长斑了，不知到你回收了么，如果片段较小要多切跑胶才能看到回收。

恩,当然是做过回收的阿
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9楼2010-10-31 19:49:06
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