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双酶切，体系，切不出来
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| 各位虫友，我在构建载体是，用Hind III和sac2进行双酶切，怎么切不出来，怎么设计体系好？怎么做才能做出来啊？ 我是先提质粒和扩出目的片段（加了酶切位点），然后根据说明书双酶切，纯化，连接，转化，涂板，挑菌，最后做了pcr，可是没有目的带！我该怎么弄比较好！！求各位虫友，给我想想办法吧！小弟不胜感激，谢谢！！！说明书中的体系是水16 buffer2 酶分别0.5 dna 1。还有连接反应说是质粒20-100ng DNA是1：1to5:1，我不知道我的浓度，就加了1ul的质粒，5ul的DNA ！ |
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 【分子生物】EPI帖 |
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【答案】应助回帖
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dhd997(金币+5, MolEPI+1): 最近很活跃啊，鼓励加鼓励 2011-09-27 07:36:32
XI4ZHL(金币+2): 2011-09-28 11:36:21
dhd997(金币+5, MolEPI+1): 最近很活跃啊，鼓励加鼓励 2011-09-27 07:36:32
XI4ZHL(金币+2): 2011-09-28 11:36:21
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1.要做连接的话，反应体系要扩大到40μL. 质粒 20μL 限制性内切酶 各2μL Buffer 4μL 双蒸水 补足到40μL 37℃反应2h以上。 2.你的质粒加的太少了，浓度太低。 3.你的目的产物说是有设计酶切位点，那酶切位点有加保护碱基吗？有些酶切位点不加保护碱基，PCR产物直接酶切是切不动的，建议你连到T载体上再酶切。 4.你的实验没有加对照，你的载体酶切，你不能确定酶切是否完全，所以对照是必须的。 对照组： 酶切后的载体 1μL 10×T4 DNA ligase Buffer 1μL T4 DNA ligase 1μL 双蒸水 up to 10μL 与实验组一起转化涂布抗性平板，看长出来的菌落多少，如果很多的话，说明你酶切不完全，要重新做过。 |
4楼2011-09-26 23:44:10
2楼2011-09-26 21:57:32
yidC423R
银虫 (初入文坛)
- 应助: 5 (幼儿园)
- 金币: 368.4
- 帖子: 47
- 在线: 10.9小时
- 虫号: 1411595
- 注册: 2011-09-21
- 专业: 膜生物化学与膜生物物理学
【答案】应助回帖
★ ★ ★
dhd997(金币+3): good 2011-09-27 07:36:03
XI4ZHL(金币+1): 2011-09-28 11:36:13
dhd997(金币+3): good 2011-09-27 07:36:03
XI4ZHL(金币+1): 2011-09-28 11:36:13
| too many possibilities. How many nucleotides did you put outside the cutting side? how do you make sure the cutting is 100%? have you checked the DNA conc after the PCR & purification? have you set up a neg control for the ligation? you have to know the conc of both fragments for the ligation. there are so many problems in your experiment. |
3楼2011-09-26 22:20:51
5楼2011-09-27 00:56:32