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emma立夏

铁虫 (初入文坛)

送鲜花一朵
引用回帖:
5楼: Originally posted by 世外清风 at 2012-05-02 08:23:32:
先测序看看吧,这样无谓的重复,不仅是对金钱的浪费,也浪费了最宝贵的时间和意志!PCR的假阳性率很高,不要太相信PCR,关键还是酶切,你可以用T载体上的酶切位点切切看,看是不是连入东西了!祝好运!

谢谢你的意见,但是由于我用的是pMD-18Tsimple vector。没有多克隆位点的。所以我只能用我片段上的酶切位点了。
11楼2012-05-07 19:49:37
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emma立夏

铁虫 (初入文坛)

送鲜花一朵
引用回帖:
7楼: Originally posted by post_ngao at 2012-05-02 20:14:59:
这种情况必须果断测序,否则一直盲做更加费钱,还费时费力。时间才是最宝贵的,一切能够用钱解决的问题都不是问题。

对的,大家都是建议测序,我也打算马上测序了,谢谢你的回复。
12楼2012-05-07 19:51:17
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emma立夏

铁虫 (初入文坛)

送鲜花一朵
引用回帖:
8楼: Originally posted by huguangdong at 2012-05-03 09:50:41:
你这个问题和保护碱基没关系,连接到T载体酶切效果比加保护碱基要好很多。PCR用的是TAQ酶吧?如果是,就直接做TA克隆,用的是哪个公司的酶?酶切效率也是问题,再就是看看水浴锅温度,用温度计测一下。还有你说你 ...

都是用TAKARA的,pcr mix ,酶也都是用的takara~~~谢谢你的提议~!!
13楼2012-05-07 21:08:19
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琼Echo

新虫 (初入文坛)

嘿,你好,现在我双酶切也遇到了跟你一样的问题,PCR检测到阳性提质粒后20微升体系酶切也切不开,送去测了一个反应,上游酶切位点没有问题,目的片段也连上了,但发现pMD19T测的那部分序列很乱(这不排除测序两端不准的可能性),但我想这应该不会造成酶切不开、、、、接下来可能需要先单酶切看看能切开否?   
看到你的帖子,所以就想问一下你的问题现在解决没有,切开了吗?
谢谢你!
恋着拟南芥的菇凉
14楼2013-10-30 17:31:10
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