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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 双酶切连TA后切不开
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查看: 2008  |  回复: 13
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emma立夏

铁虫 (初入文坛)
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5楼: Originally posted by 世外清风 at 2012-05-02 08:23:32:
先测序看看吧，这样无谓的重复，不仅是对金钱的浪费，也浪费了最宝贵的时间和意志！PCR的假阳性率很高，不要太相信PCR，关键还是酶切，你可以用T载体上的酶切位点切切看，看是不是连入东西了！祝好运！

谢谢你的意见，但是由于我用的是pMD-18Tsimple vector。没有多克隆位点的。所以我只能用我片段上的酶切位点了。
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11楼2012-05-07 19:49:37
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emma立夏

铁虫 (初入文坛)
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7楼: Originally posted by post_ngao at 2012-05-02 20:14:59:
这种情况必须果断测序，否则一直盲做更加费钱，还费时费力。时间才是最宝贵的，一切能够用钱解决的问题都不是问题。

对的，大家都是建议测序，我也打算马上测序了，谢谢你的回复。
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12楼2012-05-07 19:51:17
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emma立夏

铁虫 (初入文坛)
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8楼: Originally posted by huguangdong at 2012-05-03 09:50:41:
你这个问题和保护碱基没关系，连接到T载体酶切效果比加保护碱基要好很多。PCR用的是TAQ酶吧？如果是，就直接做TA克隆，用的是哪个公司的酶？酶切效率也是问题，再就是看看水浴锅温度，用温度计测一下。还有你说你 ...

都是用TAKARA的，pcr mix ，酶也都是用的takara~~~谢谢你的提议~！！
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13楼2012-05-07 21:08:19
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琼Echo

新虫 (初入文坛)
嘿，你好，现在我双酶切也遇到了跟你一样的问题，PCR检测到阳性提质粒后20微升体系酶切也切不开，送去测了一个反应，上游酶切位点没有问题，目的片段也连上了，但发现pMD19T测的那部分序列很乱（这不排除测序两端不准的可能性），但我想这应该不会造成酶切不开、、、、接下来可能需要先单酶切看看能切开否？   
看到你的帖子，所以就想问一下你的问题现在解决没有，切开了吗？
谢谢你！
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恋着拟南芥的菇凉
14楼2013-10-30 17:31:10
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